TC so 4

XÂY DỰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE - DNA PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A Trần Vân Khánh, Trần Quốc ðạt, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn Trường ðại học Y Hà Nội Hemophillia A (HA) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X gây nên do thiếu hụt yếu tố ñông máu FVIII. Xác ñịnh ñột biến trên gen mã hoá yếu tố FVIII (F8) ñã ñược nghiên cứu khá phổ biến. Cho ñến nay, khoảng hơn 1000 ñột biến trên gen F8 ñã ñược báo cáo. Xác ñịnh ñột b iến gen, phát hiện người lành mang gen bệnh và tư vấn di truyền là giải pháp hiệu quả nhất giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh. Việc phát hiện người lành mang gen bệnh thường ñược thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện ñột biến trực tiếp trên gen F8 dựa vào ñột biến chỉ ñiểm của bệnh nhân. Tuy nhiên, trong một số trường hợp không phát hiện thấy ñột biến hoặc việc phát hiện ñột biến gặp khó khăn do cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp có thể ñược áp dụng dựa vào xác ñịnh alen ñột biến (Linkage analysis). Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng kỹ thuật microsatellite - DNA ñể xác ñịnh tình trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân HA dựa vào phân tích các vùng trình tự lặp lại (short tandem repeat - STR), so sánh với kết quả phát hiện ñột biến trực tiếp bằng kỹ thuật giải trình tự gen.5 gia ñình bệnh nhân HA bao gồm bệnh nhân và các thành viên nữ trong gia ñình ñã ñược lựa chọn vào nghiên cứu. Kết quả cho thấy, 6 thành viên nữ của 3 gia ñình bệnh nhân HA (mẹ, bác họ, chị họ hoặc em gái) ñã ñược phát hiện là người lành mang gen bệnh. Microsatellite - DNA có thể ñược sử dụng như một kỹ thuật hiệu quả ñể phát hiện người lành mang gen bệnh HA ở Việt Nam. Từ khóa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh, microsatellite - DNA I. ðặt VẤN ðề Hemophillia A (HA) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X gây nên do thiếu hụt yếu tố ñông máu FVIII. Gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y, do vậy, người mẹ mang gen bệnh có thể truyền bệnh cho 50% con trai và truyền gen bệnh cho 50% con gái của họ [1; 2]. Bệnh có thể di truyền qua nhiều thế hệ và có nhiều người mắc bệnh trong cùng một gia ñình. Tại Việt Nam ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia và khoảng 30.000 người mang gen bệnh hemophilia A [3]. Mặc dù trong thời gian qua, ðịa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn, Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội Email: tathanhvan@hmu.edu.vn Ngày nhận: 10/8/2015 Ngày ñược chấp thuận: 9/9/2015 công tác chăm sóc bệnh nhân hemophilia A tại Việt Nam ñã có nhiều tiến bộ, số lượng bệnh nhân ñược chẩn ñoán và quản lí ñã tăng lên ñáng kể, tuy nhiên mới chỉ chiếm chưa tới 30%, còn ña số người mang gen chưa ñược chẩn ñoán và quản lí [4]. Chẩn ñoán chính xác và ñiều trị sớm căn bệnh này có ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối ña tình trạng chảy máu cũng như giảm thiểu khả năng bệnh nhân trở thành tàn tật. Xác ñịnh ñột biến trên gen mã hoá yếu tố FVIII (F8) ñã ñược nghiên cứu khá phổ biến. Cho ñến nay, khoảng hơn 1000 ñột biến trên gen F8 ñã ñược báo cáo. Có nhiều loại ñột biến khác nhau ñã ñược phát hiện trên gen F8 bao gồm: ñột biến ñiểm, ñột biến xoá ñoạn, ñột biến ñảo ñoạn [5]. Xác ñịnh ñột biến gen, phát hiện người lành mang gen bệnh và tư vấn di t ruyền là giải pháp hiệu quả nhất giúp 14 TCNCYH 96 (4) - 2015

ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh. Người phụ nữ có nguy cơ cao mang gen bệnh nếu người ñó có con trai bị bệnh hemophilia A hoặc là con gái của người mẹ mang gen bệnh; hoặc chị em con dì với người bị bệnh hemophilia A [6]. Việc phát hiện người lành mang gen bệnh thường ñược thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện ñột biến trực tiếp trên gen F8 dựa vào ñột biến chỉ ñiểm của bệnh nhân [7; 8]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp không phát hiện thấy ñột biến hoặc việc phát hiện ñột biến gặp khó khăn do cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp có thể ñược áp dụng dựa vào xác ñịnh alen ñột biến (Linkage analysis) [9-14]. Vì vậy, nghiên cứu này ñược tiến với mục tiêu: Phát triển kỹ thuật microsatellite - DNA phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân Hemophilia A. II. ðối TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. ðối tượng 5 gia ñình bệnh nhân HA bao gồm 5 bệnh nhân nam và các thành viên nữ trong gia ñình ñã ñược lựa chọn vào nghiên cứu. Các mẫu máu ñược thu thập tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương và Trung tâm nghiên cứu Gen Protein, Trường ðại học Y Hà Nội. 2. Phương pháp 2.1. Thi(t k( nghiên c/u mô t3 c4t ngang 2.2. N7i dung nghiên c/u - Xây dựng phả hệ gia ñình bệnh nhân Hemophilia A. - Xác ñịnh tình trạng mang gen của các thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân dựa vào dạng ñột biến c hỉ ñiểm ñã phát hiện ñược trên bệnh nhân. - Xác ñịnh tình trạng mang gen của các thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân bằng kỹ thuật microsatellite - DNA. 2.3. Các k< thu=t s? d@ng trong nghiên c/u * Tách chi(t DNA + DNA ñược tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi của bệnh nhân và người nhà bệnh nhân (mẹ, dì, chị gái). + Kiểm tra ñộ tinh sạch của DNA ñược tách chiết: bằng phương pháp ño quang, dựa vào tỷ lệ A 260nm /A 280nm = 1,8 2,0. * Xác ñhnh ñ7t bi(n gen F8 - Kỹ thuật giải trình tự gen xác ñịnh ñột biến ñiểm. Sử dụng 35 cặp mồi ñược thiết kế bao phủ toàn bộ chiều dài gen F8, 26 exon của gen F8 ñược khuếch ñại bằng kỹ thuật PCR và tiến hành giải trình tự theo 2 chiều [5]. - K< thu=t microsatellite - DNA Sử dụng các cặp mồi FXS 9897 và DXS 1108 ñã ñược ñánh dấu huỳnh quang ñể khuyếch ñại các vùng trình tự lặp lại STR [9; 11]. Thành phần của phản ứng PCR: 1X ñệm PCR; 2,5mM dntp; 0,2µl mồi xuôi và ngược; 0,5 unit Taq polymerase; 20ng DNA và H 2 O, tổng thể tích 20µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: 94 0 C/30 giây; [94 0 C/12 giây, 62 0 C/30 giây, 72 0 C/30 giây] x 35 chu kỳ; 72 0 C/5 phút. Sản phẩm khuếch ñại PCR ñược ñiện di trên hệ thống sequencing của hãng Beckman coulter. Kết quả ñược phân tích bằng phần mềm GeneMapper v3.2 software. 3. ðạo ñức nghiên cứu Bệnh nhân và người nhà hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi TCNCYH 96 (4) - 2015 15

không ñồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân sẽ ñược thông báo về kết quả xét nghiệm gen ñể giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác ñồ ñiều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ ñược ñảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ 1. Kết quả phát hiện người lành mang gen bằng kỹ thuật giải trình tự gen Phả hệ gia ñình bệnh nhân mã số HA23: Phả hệ gia ñình bệnh nhân mã số HA23 có một con trai bị bệnh hemophilia A (bệnh nhân mã số HA23), tiền sử bệnh gia ñình không rõ ràng, vì vậy bà ngoại, mẹ, bác và các chị họ bệnh nhân có thể là người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử. 2. Kết quả phát hiện người lành mang gen bằng kỹ thuật microsatellite-dna Sử dụng các cặp mồi FXS9897 và DXS1108 ñã ñược ñánh dấu huỳnh quang ñể khuyếch ñại các vùng trình tự lặp lại STR. Kết quả cho thấy ñã phát hiện ñược alen ở trạng thái ñồng hợp tử khi sử dụng cặp mồi FXS 9897, trong khi ñó cặp mồi DXS 1108 ở trạng thái dị hợp tử. 16 TCNCYH 96 (4) - 2015

Hình 1. Hình ảnh giải trình tự gen của gia ñình mã số HA23 Hình ảnh giải trình tự exon 23 gen F8 của người mẹ (II 3 ), bác gái (II 1 ), và chị gái họ (III 2 ) của bệnh nhân HA33 xuất hiện 2 ñỉnh chồng lên tại vị trí ñột biến ñã phát hiện ñược ở bệnh nhân HA33 (III 3 ) (c.6425t > A), chứng tỏ mẹ và chị gái họ bệnh nhân mang gen F8 ñột biến ở trạng thái dị hợp tử. TCNCYH 96 (4) - 2015 17

Alen bình thường Alen ñột biến Hình 2. Hình ảnh ñiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS 1108 của gia ñình mã số HA23 Kết quả trên cho thấy ở vùng trình tự lặp lại DXS1108, mẹ, bác gái và chị gái họ của bệnh nhân xuất hiện 2 ñỉnh, mỗi ñỉnh tương ứng với 1 alen. Ở ñỉnh trùng với ñỉnh của bệnh nhân chính là ñỉnh của alen ñột biến X b, tức là bệnh nhân sẽ nhận alen ñột biến này từ người mẹ. Bác gái và chị gái họ bệnh nhân có 1 ñỉnh trùng với ñỉnh của alen ñột biến X b chứng tỏ bác gái và chị gái họ của bệnh nhân là người lành mang gen bệnh. Kết quả này cũng trùng khớp với kết quả xác ñịnh người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen tức là cả mẹ bệnh nhân, bác gái và chị gái họ bệnh nhân là người lành mang gen bệnh. Tương tự như vậy, khi sử dụng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen và microsatellite - DNA ñể xác ñịnh tình trạng mang gen trên 4 gia ñình HA còn lại, kết quả cho thấy 2 người mẹ bệnh nhân và 1 thành viên gia ñình (em gái bệnh nhân) cũng là người lành mang gen bệnh. Trong khi ñó mẹ và các thành viên của 2 gia ñình HA còn lại không phải là người lành mang gen bệnh (bảng 1). 18 TCNCYH 96 (4) - 2015

Bảng 1. Kết quả phát hiện người lành mang gen yếu tố VIII ñột biến TT Exon Dạng ñột biến Mẹ bệnh nhân Thành viên gia ñình bệnh nhân 1 23 c.6425t > A p.leu2142stop Mang gen bệnh Bác gái và chị họ mang gen bệnh 2 23 c.6545g > A p.arg2182his Mang gen bệnh Em gái mang gen bệnh 3 3 c. 549 A > T p.lys126asp Mang gen bệnh 4 13 c.2196insa; p.674 Y Stop Không mang gen bệnh Không mang gen bệnh 5 13 c.2186deltct p.phe672del Không mang gen bệnh Không mang gen bệnh IV. BÀN LUẬN Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X và không có al en tương ứng trên nhiễm sắc thể Y. Nhiều nghiên cứu ñã tiến hành xác ñịnh ñột biến gen F8 trên bệnh nhân Hemophilia A và cho ñến nay khoảng hơn 1000 ñột biến trên gen F8 ñã ñược báo cáo. Có nhiều loại ñột biến khác nhau ñã ñược phát hiện trên gen F8 bao gồm: ñột biến ñiểm, ñột biến xoá ñoạn, ñột biến ñảo ñoạn [5]. Kết quả xác ñịnh ñột biến gen F8 trên bệnh nhân là cơ sở khoa học cho những phân tích phát hiện ñột biến gen ñối với các thành viên trong gia ñình bệnh nhân và phát hiện người lành mang gen bệnh, chẩn ñoán trước sinh ñể ñưa ra những tư vấn di truyền là giải pháp hiệu quả nhất giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh [7; 8]. Trong số các bà mẹ ñược xác ñịnh người lành mang gen bệnh, khoảng 2/3 ñược phát hiện là người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử, còn lại 1/3 các trường hợp người mẹ không mang gen bệnh, ñột biến xuất hiện ở người con trai bị bệnh là ñột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc từ người mẹ (denovo mutation) [7]. ðiều này có thể giải thích cho 2 người mẹ bệnh nhân không phải là người lành mang gen bệnh ở trong nghiên cứu này mặc dù con của họ ñược phát hiện là có ñột biến trên gen F8. Ba người mẹ của 3 gia ñình và các thành viên nữ của 3 gia ñình còn lại ñược xác ñịnh là người lành mang gen bệnh bằng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp và microsatellite - DNA. Thông thường, việc phát hiện người lành mang gen bệnh thường ñược thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện ñột biến trực tiếp trên gen F8 dựa vào ñột biến chỉ ñiểm của bệnh nhân. Tuy nhiên, trong một số trường hợp không phát hiện thấy ñột biến hoặc việc phát hiện ñột biến gặp khó khăn do cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp có thể ñược áp dụng dựa vào xác ñịnh alen ñột biến (Linkage analysis) [7; 8]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển kỹ thuật microsatellite - DNA ñể xác ñịnh tình trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân Hemophilia A dựa vào phân tíc h các vùng trình tự lặp lại (short tandem repeat - STR), so sánh với kết quả TCNCYH 96 (4) - 2015 19

phát hiện ñột biến trực tiếp bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Trình tự lặp lại là các ñoạn lặp nối tiếp ngắn từ 2 ñến 6 cặp base, nằm ở các ñoạn intron, có tính ña hình rất cao và ñược phân bố khắp trong bộ gen. Các trình tự nhỏ dưới 1000 base tạo nên bởi các trình tự lõi khoảng 2 ñến 4 base lặp lại nhiều lần (từ 10 ñến 60 lần). Do kích thước nhỏ nên các trình tự này ñược gọi là các trình tự lặp lại ngắn - STR và số lần lặp lại của các trình tự nhỏ này ñặc trưng cho từng cá thể và mang tính di truyền. Trình tự lặp lại ngắn ñược ứng dụng chẩn ñoán xác ñịnh huyết thống, xác ñịnh người mang gen và chẩn ñoán trước sinh [9-14]. Trong nghiên cứu này, các cặp mồi sử dụng khuếch ñại trình tự lặp lại trên gen F8, nhằm xác ñịnh alen mang ñột biến X b và alen không mang gen ñột biến X. Với kết quả phân tích trình tự lặp lại ngắn, người mẹ hoặc các thành viên nữ trong gia ñình khác sẽ có 2 ñỉnh tương ứng với 2 alen do họ có 2 nhiễm sắc thể X, bệnh nhân nam nhận nhiễm sắc thể Y từ bố và một nhiễm sắc thể X từ mẹ, nên sẽ chỉ có 1 trình tự lặp lại giống của mẹ vì gen F8 chỉ có trên nhiễm sắc thể X; trên hình ảnh ñiện di sẽ cho một ñỉnh duy nhất tương ứng với trình tự lặp lại ngắn trên nhiễm sắc thể X nhận từ mẹ. ðỉnh của alen ñột biến sẽ ñược xác ñịnh dựa trên ñỉnh alen của bệnh nhân. Trong trường hợp các thành viên gia ñình bệnh nhân có 1 ñỉnh trùng với ñỉnh của alen ñột biến X b chứng tỏ họ là người lành mang gen bệnh và ngược lại không trùng với ñỉnh của alen ñột biến chứng tỏ họ không phải là người lành mang gen bệnh. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy 6 thành viên nữ của 3 gia ñình bệnh nhân Hemophilia A (mẹ, bác họ, c hị họ hoặc em gái) ñã ñược phát hiện là người lành mang gen bệnh dựa trên phân tích kết quả trình tự lặp lại ngắn. Kết quả này cũng hoàn toàn trùng khớp với kết quả xác ñịnh người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen. V. KẾT LUẬN ðã hoàn thiện quy trình xác ñịnh người lành mang gen bệnh ở các thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân Hemophilia A bằng kỹ thuật Microsatellite - DNA. Lời cám ơn Nghiên cứu ñược thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi ðề tài cấp nhà nước Xây dựng quy trình chẩn ñoán trước làm tổ bằng kỹ thuật microsatellte DNA ñể sàng lọc một số bệnh lý di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính thuộc thuộc chương trình KC04.17/11-15. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Gill Swallow (2013). Guideline for the Obstetric Management of Carriers of Haemophilia A and B, NHS Nottingham University Hospitals Cookie Disclaime. 2. Trần Thị Liên, Trần Thị Thanh Hương (2014). Di truyền ñơn gen, Di truyền y học, Nhà xuất bản giáo dục, 146-149. 3. Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Mai (2009). Quản lí, chẩn ñoán và ñiều trị hemophilia ở Việt Nam: Quá khứ - Hiện tại Tương lai, Y học Việt Nam, 2, 3-12. 4. Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Nữ và cộng sự (2012). Nghiên cứu phát hiện Hemophilia dựa vào phả hệ gia ñình các bệnh nhân ñã ñược chẩn ñoán tại viện Huyết học Truyền máu Trung ương, Báo cáo Hội nghị nghiên cứu sinh Trường ñại học Y Hà Nội lần thứ XVIII, 156-162. 5. Azza A.G. Tantawy (2010). Molecular genetics of hemophilia A: Clinical perspec- 20 TCNCYH 96 (4) - 2015

tives. The Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 11, 105-114. 6. Street AM, Ljung R, Lavery SA (2008). Management of carriers and babies with haemophilia. Haemophilia, 14(3), 181-187. 7. Goodeve A.C (1998). Advances in carrier detection in haemophilia. Haemophilia, 4 (4), 358-364. 8. Shetty S, Ghosh K, Bhide A, Mohanty D (2001). Carrier detection and prenatal ldiagnosis in families with hemophilia. Natl Med J India, 14, 81-83. 9. Machado FB, Medina - Acosta E (2009). High-resolution combined linkage physical map of short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28 for indirect haemophilia A carrier detection. Haemophilia, 15(1), 297-308. 10. Ding QL, Lu YL, Dai J et al (2012). Characterisation and validation of a novel panel of the six short tandem repeats for genetic counselling in Chinese haemophilia A pedigrees. Haemophilia, 18(4), 621-625. 11. Saha A, Nayak S, Mani KR et al (2011). A set of five microsatellite markers linked to F8 gene can detect haemophilia A carriers across India. Haemophilia, 17(5), 928-935. 12. Massaro JD, Wiezel CE, Muniz YC et al (2011). Analysis of five polymorphic DNA markers for indirect genetic diagnosis of haemophilia A in the Brazilian population. Haemophilia, 17(5), 936-943. 13. Hussein IR, El-Be shlawy A, Salem A, et al (2008).The use of DNA markers for carrier detection and prenatal diagnosis of haemophilia A in Egyptian families.haemophilia, 14(5), 1082-1087. 14. de Carvalho FM, de Vargas Wolfgramm E et al (2007). Analysis of Factor VIII polymorphic markers as a means for carrier detection in Brazilian families with haemophilia A. Haemophilia, 13(4), 409-412. Summary DETECTION OF HEMOPHILIA A CARRIER USING MICROSATELLITE DNA Hemophilia A is an inherited X - linked coagulation disorder caused by factor VIII (FVIII) deficiency. Genetic mutations in the gene encoding FVIII (F8) have been extensively studied. Over a thousand different mutations have been reported in the F8 gene. Carrier detection and genetic counseling are effective solutions to prevent and reduce the incidence of disease. Carrier are preferably performed by direct mutation detection; however, in certain situations, indirect family studies may also be useful in c ases of undetectable mutation due to F8 gene large structure. We aimed to utilize a combination of direct and indirect techniques for the diagnosis of carrier of Hemophilia A. Linkage analysis is a common indirect method for the detection of female carriers in families with Hemophilia A. In this study, we compared results obtained from linkage using short tandem repeat-strs linkage (microsatellite - DNA) with those by sequencing analysis. 10 hemophilia A families including patients and female members were recruited for this study. By sequencing analysis, five Hemophilia A patients and their family members (mother, aunt, cousins and sister) showed small point mutation including missense mutation and insertion in F8 gene while Micros atellite-dna revealed the transmission of a mutant allele inside each family. In TCNCYH 96 (4) - 2015 21

conclusions, the combination of direct and indirect molecular genetics approaches is a successful method and microsatellite - DNA is a cost-effective approach to provide carrier diagnostics of hemophilia A in Vietnam. Keywords: Hemophilia, carriers, microsatellite - DNA 22 TCNCYH 96 (4) - 2015