BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ LIỄU NGHIÊN

Bản ghi

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ LIỄU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI LÁ KIM Ở TÂY NGUYÊN, VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà nội-2018

2 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TSKH. Trần Văn Sung Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Đinh Thị Phòng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3:. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ.., ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam

3 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Khí hậu Việt Nam phân hóa đa dạng theo địa hình, với đặc điểm đa dạng về khí hậu đã tạo ra một thảm thực vật vô cùng phong phú. Loài cây lá kim là những loài cây quan trọng cả về sinh thái, kinh tế và văn hóa tại nhiều địa phương như Lâm Đồng, KomTum, Gia Lai Theo số liệu thống kê của Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự (2005), trong số 34 loài lá kim ở Việt Nam có tới 15 loài ở Tây Nguyên (chiếm 44,11%). Vì thế mà Tây Nguyên được coi là cái nôi các loài lá kim có tính đa dạng vào hàng thứ hai ở Việt Nam, đặc biệt là tại Đắk Lắk, Kon Tum và Lâm Đồng. Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) là những loài cây lá kim có giá trị kinh tế của khu vực Tây Nguyên, Việt Nam. Tuy nhiên, cho tới nay loài Kim giao núi đất vẫn chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cả trong và ngoài nước, trong khi Đỉnh tùng mới chỉ được nghiên cứu hạn chế tại một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản và chưa được nghiên cứu tại Việt Nam, Hoàng đàn giả mới chỉ có nghiên cứu thành phần hóa học qua tinh của dầu lá.vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài lá kim trên có nhiều triển vọng tìm ra chất có cấu trúc mới và có hoạt tính sinh học lý thú làm tiền đề cho việc nghiên cứu, phát triển thuốc chữa bệnh góp phần nâng cao giá trị nguồn tài nguyên sẵn có ở vùng Tây Nguyên. Kết hợp với kết quả nghiên cứu về đa dạng nguồn gen di truyền tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc bảo tồn và phát triển bền vững các loài cây lá kim tại khu vực Tây Nguyên, Việt Nam. Xuất phát từ các cơ sở khoa học nêu trên chúng tôi lựa chọn đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây nguyên, Việt Nam 2. Mục tiêu của luận án. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài lá kim nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao và có cấu trúc hóa học lí thú. Kết hợp với kết quả của nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền giúp cho công tác bảo tồn các loài lá kim một loài cây quan trọng của vùng Tây Nguyên, Việt Nam. 1

4 3. Những nghiên cứu chính của luận án. - Phân lập các hợp chất từ các bộ phận của 3 loài lá kim nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký cột. - Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng phương pháp phổ IR, MS, 1D-NMR, 2D-NMR kết hợp với các phương pháp vật lí khác - Thử hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các chất sạch phân lập được. - Đánh giá tính đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim nghiên cứu bằng 2 loại chỉ thị ISSR và SSR. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về 3 loài lá kim nghiên cứu Đặc điểm thực vật và tình trạng bảo tồn Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii) Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài trong chi Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia Thành phần hóa học Hoạt tính sinh học 1.2. Ứng dụng kĩ thuật phân tích ISSR và SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) Một số thành tựu về nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài thuộc chi Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia. 2

5 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu thực vật Nghiên cứu thành phần hóa học Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Mẫu lá, vỏ thân của loài Đỉnh tùng tiêu bản số CPC 4718; Mẫu lá, cành và vỏ thân của loài Kim giao núi đất mẫu tiêu bản Nr. CPC 4715; Mẫu gỗ thân, cành của loài Hoàng đàn giả tiêu bản số CPC 4708 được thu hái tại tỉnh Lâm Đồng vào tháng 8 / 2012 do Tiến sĩ Nguyễn Tiến Hiệp,Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học và giữ tại Bảo tàng thiên nhiên, VAST, Hà Nội, Việt Nam Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền Những mảnh lá/vỏ gỗ/rễ của 3 loài. Mỗi loài nghiên cứu lựa chọn 70 cá thể (riêng loài Đỉnh tùng chỉ có 34 cá thể) Hóa chất, thiết bị Nghiên cứu về hóa học Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền 2.3. Chiết tách các chất từ 3 loài lá kim Phương pháp nghiên cứu Phương pháp chiết mẫu thực vật Mẫu thực vật của 3 loài nghiên cứu được chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần Phương pháp xác định cấu trúc Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện việc kết hợp các phương pháp phổ (FT IR), phổ khối (MS), (1D và 2D NMR) Chiết tách các chất từ 3 loài lá kim Đỉnh tùng (C. mannii) Chiết alkaloid bộ phận lá cây Đỉnh tùng (1 kg) thu được 6 gam alkaloid tổng. Từ vỏ cây Đỉnh tùng (0,5 kg) thu được 7,9 gam alkaloid tổng và 30 g dịch chiết EtOAc không chứa alkaloid. Từ 6 gam alkaloid tổng của lá và cành Đỉnh tùng (ĐTL), được chạy sắc ký cột silica gel hệ dung môi CH 2 Cl 2 / MeOH (98 : 2), sau đó tăng dần đến tỉ lệ 3

6 (1:1). Tiếp tục sắc ký cột trên silica gel nhiều lần các phân đoạn đã phân lập được 2 hợp chất sạch kí hiệu là DT1 (30mg) và DT7 (11 mg). Từ 7,9 gam cặn vỏ alkaloid tổng (ĐTV) phân tách bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH 2 Cl 2 : MeOH (1:0) tăng dần tỉ lệ phân cực và kết thúc cột (0:1) thu được 9 phân đoạn (ĐTV.1 ĐTV.9). Tiếp tục sắc ký cột trên silica gel nhiều lần các phân đoạn đã phân lập được 7 hợp chất sạch kí hiệu là DT2 (21 mg), DT3 (18 mg), DT4 (15 mg), hỗn hợp DT5 (120 mg) (DT5.1 và DT5.2), DT6 (30 mg), DT8 (50 mg). Từ dịch chiết EtOAc (30 gam) phần không chứa alkaloid, chạy sắc ký cột silica gel hệ dụng môi (CH 2 Cl 2 / MeOH; 95:5) đã phân lập được 2 hợp chất flavonoid là: Epicatechin DT9 (20 mg) và Epigallocatechin DT10 (25 mg). Phân lập, tinh chế các chất từ dịch chiết alkaloid tổng Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các chất từ vỏ Đỉnh tùng Hoàng đàn giả (D. elatum) 13 gam cao chiết EtOAc (HĐE) được phân tách bằng phương pháp sắc kí cột silica gel nhiều lần với các hệ dung môi thích hợp thu được 6 chất sạch kí 4

7 hiệu HĐ1 (15 mg), HĐ2 (10 mg), HĐ3(15 mg), HĐ4 (11 mg), HĐ5 (16 mg), HĐ6 (14 mg). Hình 2.5. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc mẫu thân và cành Hoàng đàn giả Kim giao núi đất (N. wallichiana) Từ cao chiết n-hexane (8,0 g) sắc ký cột trên silica gel (n-hexane : CH 2 Cl 2 ) nhiều lần các phân đoạn đã phân lập được 2 hợp chất sạch kí hiệu là KG6 (15 mg) và KG7 (11mg). Từ cao chiết methanol (20 g) sắc ký cột trên silica gel và sephadex nhiều lần thu được 1 chất sạch kí hiệu KG10 (12 mg). Tiến hành sắc ký cột silica gel cao chiết dịch ethyl acetate (43 g) hệ dung môi (n-hexane : EtOAc ; 95 : 5 0:100) thu được 33 phân đoạn kí hiệu từ KGE.1 đến KGE.33. Chọn chạy sắc ký cột silica gel các phân đoạn KGE.11 (570 mg); KGE.22 (653 mg); KGE.29 (353 mg); KGE.31 (3,4 g) và KGE.32 (1g) với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực khác nhau thu được 7 chất sạch là KG1, KG2, KG3, KG4, KG5, KG8, KG9. 5

8 Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc lá và cành Kim giao núi đất Số liệu phổ các hợp chất phân lập được từ 3 loài lá kim nghiên cứu. Hợp chất DT1: Cephalotaxine (+) ESI-MS: m / z 316 [M + H] +, CTPT là C 18 H 21 NO 4. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 4,92 (s H-1), 4,75 (d, J = 9,0, H-3), 3,67 ( d, J = 9,0, H-4), 2,00 (m, H-6a), 1,86 (m, H-6b), 1,75 (m, H-7), 3,06 (m, H-8), 2,92 ( td, J =11,0; 7,0, H-10), 2,35 (dd, J =14,5; 6,5, H-11a), 3,35m (H-11b), 6,64 (s, H-14), 6,67 (s, H-17), 5,90 (s, H-18), 3,72 (s, H-19). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 97,6 (C-1), 160,5 (C-2), 73,3 (C-3), 57,2 (C-4), 70,6 (C-5), 43,5 (C-6), 20,3 (C-7), 53,8 (C-8), 48,5 (C-10), 31,6 (C-11), 134,2 (C-12), 128,0 (C-13), 112,6 (C-14), 146,9 (C-15), 146,1 (C-16), 110,3 (C-17), 110,9 (C-18), 57,2 (C-10). Hợp chất DT2: Cephalotaxine β N-oxide (+) HR-ESI-MS: m / z 354,1303 [M + Na] + và [M + H] +. CTPT là C 18 H 21 NO 5. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 4,79 (s, H-1), 4,15 (d, J = 4,3, H-3), 3,40 (d, J = 4,3, H-4), 2,01 (m, H-6a), 2,01 (m, H-6b), 2,18 (m, H-7a), 2,30 (m, H-7b), 3,35 (m, H-8a), 3,40 (m, H-8b), 3,42 (m, H-10a), 3,51 (m, H- 10b), 2,26 (m, H-11a), 3,84 (m, H-11b), 6,58 (s, H-14), 6,58 (s, H-17), 5,90 (s, H-18a), 5,94 (s, H-18b), 3,76 (s, H-19). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 6

9 97,94 (C-1), 169,83 (C-2), 77,63 (C-3), 58,30 (C-4), 89,39 (C-5), 30,05 (C-6), 17,52 (C-7), 69,05 (C-8), 63,20 (C-10), 29,85 (C-11), 134,07 (C-12), 126,99 (C-13), 112,88 (C-14), 146,43 (C-15), 146,99 (C-16), 110,18 (C-17), 101,16 (C-18), 57,14 (C-19). Hợp chất DT3: Deoxyharringtonine (+) ESI-MS: m / z 516 [M + H] + và 298 [100, M C 10 H 17 O 5 ] +, CTPT C 28 H 37 NO 8. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 5,04 (d, J = 0,5, H-1), 6,00 ( dd, J = 0,5, 10, H-2), 3,77 ( d, J = 10, H-4), 6,53 (s, H-14), 6,62 (s, H-17), 5,85 (d, J = 1,5 Hz, H-18a), 5,87 (d, J = 1,5 Hz, H-18b), 3,68 (s, H-19), 3,57 (s, H- 5 ), 0,97 (m, H-2 α), 1,28 (m, H-2 β), 1,41 (m, H-3 ), 0,83 (3H, d, J = 6,7; H- 4 a), 0,84 (3H, d, J = 6,7, H-5 a). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 100,08 (C-1), 157,83 (C-2), 74,61 (C-3), 55,91 (C-4), 70,63 (C-5), 43,40 (C-6), 20,32 (C-7), 53,94 (C-8), 48,63 (C-10), 31,37 (C-11), 133,33 (C-12), 128,48 (C-13), 112,67 (C-14), 146,67 (C-15), 145,83 (C-16), 109,71 (C-17), 100,80 (C-18), 57,12 (C-19), 174,07 (C-1 ), 74,74 (C-2 ), 42,77 (C-3 ), 170,47 (C-4 ), 51,49 (C-5 ), 36,74 (C-1 ), 31,60 (C-2 ), 28,01 (C-3 ), 22,26 (C-4 ), 22,68 (C- 5 ). Hợp chất DT4: Nordeoxyharringtonine (+) HR-ESI-MS: m / z 502,24405 [M + H] +, CTPT C 27 H 35 NO 8. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 5,03 (s, H-1), 5,95 (d, J = 10, H-3), 3,76 (d, J = 10, H-4), 6,52 (s, H-14), 6,61 (s, H-17), 5,86 (d, J =1,5, H-18a), 5,83 (d, J =1,5, H- 18b), 3,65 (s, H-19), 3,55 (s, H-5 ), 0,83 ( d, J = 6,5, H-3 a), 0,89 ( d, J = 6,5, H- 4 a). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 100,0 (C-1), 157,7 (C-2), 75,1 (C- 3), 55,8 (C-4), 70,5 (C-5), 43,3 (C-6), 20,2 (C-7), 53,8 (C-8), 48,5 (C-10), 31,2 (C-11), 133,2 (C-12), 128,3 (C-13), 112,6 (C-14), 146,6 (C-15), 145,7 (C-16), 109,6 (C-17), 100,7 (C-18), 57,0 (C-19), 174,3 (C-1 ), 74,7 (C-2 ), 43,3 (C-3 ), 170,4 (C-4 ), 51,3 (C-5 ), 46,6 (C-1 ), 24,0 (C-2 ), 23,8 (C-3 ), 23,9 (C-4 ). Hợp chất DT5.1: Isoharringtonine (+) HR-ESI-MS: m / z 532,25485 [M + H] +, CTPT là C 28 H 37 NO 9. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 5,08 (s, H-1), 6,03 (d, J = 9,8, H-3), 3.79 (d, J = 9,8, H-4), 6,54 (s, H-14), 6,65 (s, H-17), 5,80 s; 5,86 brs (H-18), 3,69 (s, H-19), 3,35 (s, H-3 ), 3,61 (s, H-5 ), 0,85 (d, J = 6,7, H-4 ), 0,87 (d, J = 6,7, H-5 ). 7

10 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 100,44 (C-1), 157,52 (C-2), 74,67 (C-3), 55,81 (C-4), 70,66 (C-5), 43,34 (C-6), 20,25 (C-7), 53,84 (C-8), 48,44 (C-10), 31,37 (C-11), 128,28 (C-12), 133,35 (C-13), 112,61 (C-14), 146,69 (C-15), 145,65 (C-16), 109,88 (C-17), 100,81 (C-18), 57,10 (C-19), 173,00 (C-1 ), 79,13 (C-2 ), 75,43 (C-3 ), 171,65 (C-4 ), 52,28 (C-5 ), 32,99 (C-1 ), 31,72 (C- 2 ), 28,06 (C-3 ), 22,71 (C-4 ), 22,22 (C-5 ). Hợp chất DT5.2: Norisoharringtonine (+) HR-ESI-MS: 518,23903 [M + H] +, CTPT là C 27 H 35 NO 9. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 5,08 (s, H-1), 6,00 (d, J = 9,8, H-3), 3,79 (d, J = 9,8, H-4), 6,54 (s, H-14), 6,65 (s, H-17), 5,80 s; 5,86 br s (H-18), 3,68 (s, H- 19), 3,28 (s, H-3 ), 3,63 (s, H-5 ), 0,96 (d, J = 6,7, H-3 ), 0,97 (d, J = 6,7, H- 4 ), 5,08 (s, H-5 ). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 100,44 (C-1), 157,52 (C-2), 75,03 (C-3), 55,81 (C-4), 70,66 (C-5), 43,34 (C-6), 20,25 (C-7), 53,84 (C-8), 48,44 (C-10), 31,37 (C-11), 128,28 (C-12), 133,35 (C-13), 112,65 (C- 14), 146,65 (C-15), 145,65 (C-16), 109,88 (C-17), 100,81 (C-18), 57,10 (C-19), 173,20 (C-1 ), 79,79 (C-2 ), 75,34 (C-3 ), 171,55 (C-4 ), 52,33 (C-5 ), 32,14 (C-1 ), 24,27 (C-2 ), 24,29 (C-3 ), 23,71 (C-4 ). Hợp chất DT6: 3-epischellhammericine (+) ESI-MS: 314 [M+H] + và 282 [M+H CH 3 OH] +, CTPT C 19 H 23 NO 3. 1 H- NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 5,54 (br s, H-1), 3,23 (m), 1,56 (t, J = 11,0; H-4ax), 6,72 (s, H-15), 6,60 (s, H-18), 5,90 (d, J = 1,0, H-19a), 5,88 (d, J = 1,0, H-19b), 3,29 (s, H-20). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 127,92 (C-1), 46,34 (C-2), 76,00 (C-3), 36,03 (C-4), 68,84 (C-5), 131,61 (C-6), 28,79 (C-7), 51,14 (C-8), 54,60 (C-10), 28,65 (C-11), 37,36 ( C-12), 134,59 ( C-13), 136,40 (C-14), 108,79 (C-15), 145,65 (C-16), 145,37( C-17), 111,34 (C-18), 100,83 (C- 19), 55,83 (C-20). Hợp chất DT7: Manniicine (+) ESI-MS: m / z 314,1745 [M + H] +, CTPT là C 19 H 23 NO 3. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz), δ H (ppm): 6,02 (ddd, J = 1,9; 4,5; 10,2 Hz, H-1), 5,08 (br d, J = 10,2 Hz, H-2); 1,85 (1H, t, J = 13,0 Hz, H-4ax); 3,24 (3H, s, H-20); 5,92 (d, J = 1,5 Hz, H- 19a), 5,91 (d, J = 1,5 Hz, H-19b). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz), δ C (ppm): 116,18 (C-1), 130,87 (C-2), 74,29 (C-3), 32,07 (C-4), 68,18 (C-5), 38,56 (C-6), 27,56 8

11 (C-7), 46,49 (C-8), 50,05 (C-10), 22,99 (C-11), 37,42 (C-12), 128,82 (C-13), 135,57 (C-14), 111,42 (C-15), 145,78 (C-16), 144,99 (C-17), 111,55 (C-18), 100,88 (C-19), 55,85 (C-20). Hợp chất DT8: Harringtonolid (+)-ESI-MS: m / z 311,12835 [M + H] +, CTPT là C 19 H 18 O 4. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 6,87 (t, 1,8, H-2), 5,35-5,36 (m, H-5), 1,28 (m, H-6), 2,65 (m, H-7), 6,95 (br s, H-10), 3,41 (m, H-11), 2,81 (m, H-12), 1,75 (q, 7,6, H- 14), 5,19 (m, H-15), 3,98 (d, 5,6, H-16), 0,88 (d, 7,6, H-18), 2,37 (s, H-19). 13 C- NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 186,33 (C-1), 139,10 (C-2), 143,47 (C-3), 144,92 (C-4), 79,91 (C-5), 41,70 (C-6), 49,85 (C-7), 145,58 (C-8), 145,78 (C-9), 141,44 (C-10), 32,24 (C-11), 22,31 (C-12), 45,72 (C-13), 39,92 (C-14), 79,62 (C- 15), 85,96 (C-16), 173,40 (C-17), 14,65 (C-18), 23,76 (C-19). Hợp chất DT9: Hợp chất Epicatechine 1 H-NMR (CD 3 OD, δ ppm): 2,78 (dd, J = 17,0, 2,0, H-4ax); 2,89 (dd, J = 16,0, 4,5 Hz, H-4eq); 4,88 (br d, J = 7,5 Hz, H-2), 4,2 (H-3), 5,97 (1H, d, J = 2,5, H-6), 5,94 (1H, d, J = 2,5, H-8); 6,78 (d, J = 8,5 Hz; H-5 ); 7,00 (d, J = 2,5 Hz; H-2 ), 6,82 (dd, J = 10,0; 2,0 Hz, H-6 ). 13 C-NMR (CD 3 OD, δ ppm): 67,43 (C2); 79,81 (C3); 29,23 (C4); 157,32 (C5); 95,87 (C6);157,95 (C7); 96,36 (C8);157,58 (C9); 100,10 (C10); 132,24 (C1 ); 115,28 (C-2 ); 145,88 (C3 ); 145,71 (C4 ); 115,88 (C5 ); 119,39 (C6 ). Hợp chất DT10: Epigallocatechine 1 H-NMR (CD 3 OD, δ ppm): 2,75 ppm (H-4ax); 2,89 ppm (H-4eq), 4,54 ppm (d, J =7,0 Hz, H-2) và tín hiệu ở δ H 4,19 ppm (s, H-3), 6,54 (2H, s, H-2 ; H-6 ) ; 5,94 (d, J = 2,5, H-6), 5,96 (d, J = 2,5, H-6). Hợp chất HĐ1: Lambertic acid (-) ESI-MS: m / z = 315 [M-H] - và (+) ESI-MS: m / z = 317 [M+H] +, CTPT là C 20 H 28 O 3. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 1,54 (d, J = 12,0, H- 5); 2,73 (dd, J = 6,0, H-7); 6,62 (s, H-11); 6,63 (s, H-14); 3,11 (m, H-15); 1,22 (d, J = 7,0, H-16); 1,4, J = 7,0, H-17); 1,32 (s, H-18); 1,10 (s, H-20). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 39,37 (C-1); 19,91 (C-2); 37,44 (C-3); 43,84 (C-4); 52,77 (C-5); 21,10 (C-6); 31,27 (C-7); 127,45 (C-8); 146,46 (C-9); 38,33 (C- 10); 111,94 (C-11); 150,86 (C-12); 131,89 (C-13); 126,72 (C-14); 26,86 (C-15); 9

12 22,54 (C-16); 22,70 (C-17); 28,73 (C-18); 23,13 (C-20). Hợp chất HĐ2: Dacrydianone (chất mới) (+) HR-ESI-MS: m / z = 315,1966 [M+H] +, và (-) ESI-MS: m / z = 313 [M- H] -, CTPT là C 20 H 26 O 3. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 1,73-1,81 (m, H- 1a); 2,40-2,44 (m, H-1b); 1,73-1,81 (m, H-2a); 1,91-2,00 (m, H-2b); 1,56-1,68 (m, H-3b); 7,34 (s, H-11); 7,47 (s, H-14); 3,33 (m, H-15); 1,27 (d, J = 7,0 Hz, H-16); 1,29 (d, J = 7,0 Hz, H-17); 1,44 (s, H-18); 1,44 (s, H-19); 1,52 (s, H-20). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 33,43 (C-1); 17,49 (C-2); 37,71 (C-3); 36,07 (C-4); 143,06 (C-5); 143,86 (C-6); 180,17 (C-7); 125,86 (C-8); 147,86 (C-9); 40,63 (C-10); 123,64 (C-11); 141,83 (C-12); 151,73 (C-13); 110,83 (C- 14); 27,84 (C-15); 22,28 (C-16); 22,53 (C-17); 27,50 (C-18); 28,05 (C-19); 34,88 (C-20). Hợp chất HĐ3: Daucosterol (β-sitosterol-3-o-β-d-glucopyranoside 1 H-NMR (DMSO-d 6, 500 MHz) δ (ppm): 1,25 (2H, m, H-1a,b), 3,13 (1H, m, H-3), 5,09 (1H, br, H-6), 0,62 ( 3H, s, H-18 ), 0,94 (3H, s, H-19 ), 0,84 (3H, d, J = 6,3, H-21), 0,75 (3H, d, J = 6,8, H-26 ), 0,73 (3H, d, J = 6,8, H-27), 0,77 (3H, t, J = 6,9, H-29). 13 C-NMR (DMSO-d 6, 125 MHz) δ (ppm): 36,85 (C-1), 29,12 (C- 2), 78,61 ( C-3), 42,12 (C-4), 139,98 (C-5), 121,54 (C-6), 31,41 (C-7), 31,46 (C-8), 49,83 (C-9), 36,27 (C-10), 20,21 (C-11), 38,20 ( C-12), 41,88 (C-13), 56,36 (C-14), 23,79 (C-15), 27,76 (C-16), 55,66 (C-17), 11,27 (C-18), 19,10 (C-19), 35,70 (C-20), 18,69 (C-21), 33,51 (C-22), 25,64 (C-23), 45,49 (C-24), 28,74 (C-25), 18,69 (C-26), 18,35 (C-27), 22,60 (C-28), 12,29 (C-29), 100,74 (C-1 ), 73,21 (C-2 ), 76,18 (C-3 ), 69,90 (C-4 ), 75,62 (C-5 ), 61,36 (C-6 ). Hợp chất HĐ4: Ponasterone A (+)-ESI-MS: m / z = 522,7 [M+Na+2H 2 O] +, (-)-ESI-MS: m / z = 499 [M+Cl] - cho CTPT C 27 H 44 O 6. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 3,97 (d, J = 2,2, H-2), 3,84-3,88 (m, H-3), 5,83 (d, J = 2,20, H-7), 0,92 (s,h-18), 0,99 (s, H- 19), 1,20 (s, H-21), 3,36 (m, H-22), 0,94 (d, J = 6,5, H-26), 0,93 (d, J = 6,5, H- 27). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 37,39 (C-1), 68,71 (C-2), 68,53 (C- 3), 32,86 (C-4), 51,80 (C-4), 206,45 (C-6), 122,13 (C-7), 167,96 (C-8), 35,12 (C- 9), 39,27 (C-10), 21,51 (C-11), 32,53 (C-12), 85,24 (C-14), 31,76 (C-15), 21,51 (C-16), 50,48 (C-17), 18,03 (C-18), 24,41 (C-19), 77,85 (C-20), 21,00 (C-21), 10

13 77,98 (C-22), 37,66 (C-23), 30,48 (C-24), 29,22 (C-25), 22,75 (C-26), 23,41 (C- 27). Hợp chất HĐ5: 20-hydroxyecdysone (+)-ESI-MS: m / z = 463 [M+H-H 2 O] +, 445 [M+H-2H 2 O] +, 427 [M+H- 3H 2 O] +, 409[M+H-4H 2 O] +. (-) ESI-MS: m / z = 515 [M + Cl] -, 479 [M-1] -, 461 [M-1-H 2 O] -, CTPT là C 27 H 44 O 7. 1 H-NMR (CD 3 OD, 500 MHz) δ (ppm): 1,82 (m, 1-Hα); 1,45 (m, H-1β), 3,86 (dt, J = 11,5; 2,1, H-2), 3,97 (d, J = 2,1, H-3), 2,39-2,43 (m, H-5), 5,83 (d, J = 2,2, H-7), 3,18 (t, J = 8,2, H-9), 2,39-2,43 (m, H-17), (0,91 s, H-18), 0,99 (s, H-19), 1,20 (s, H-21), 3,36 (m, H-22), 1,22 (s, H-26), 1,21 (s, H-27). 13 C-NMR (CD 3 OD, 125 MHz) δ (ppm): 37,78 (C-1), 68,69 (C-2), 68,52 (C-3), 32,51 (C-4), 51,78 (C-5), 206,44 (C-6), 122,13 (C-7), 167,97 (C-8), 35,10 (C-9), 39,28 (C-10), 21,50 (C-11), 31,78 (C-12), 49,00 (C-13), 85,23 (C- 14), 32,83 (C-15), 21,50 (C-16), 50,53 (C-17), 18,04 (C-18), 24,40 (C-19), 78,41 (C-20), 21,26 (C-21), 77,91 (C-22), 27,35 (C-23), 42,38 (C-24), 71,29 (C-25). Hợp chất HĐ6: Ajugasterone C (-) ESI-MS: m / z = 515 [M + Cl] -, (+) ESI-MS: m / z = 538,8 [M+ Na+2H 2 O] +. CTPT là C 27 H 44 O 7. 1 H-NMR (CD 3 OD, 500 MHz) δ (ppm): 4,03 (dt, J = 3,6; 11,6, H-2), 3,97 (d, J = 2,6, H-3 ), 1,69-1,83 (m, H-4), 2,35 (dd, J = 13,0; 4,0, H-5), 5,82 (d, J =2,2, H-7), 3,17 (dd, J = 8,9; 2,6, H-9), 4,12 (m, H- 11), 2,16 (m, H-12a), 2,15 (m, H-12b), 2,43 (t, J = 9,0, H-17), 0,89 (s, H-18a), 1,08 (s, H-18b), 1,22 (s, H-21), 3,35 (m, H-22), 1,23-1,27 (m, H-23), 1,61 (m, H-25), 0,94 (d, J = 6,5, H-26), 0,93 (d, J = 6,5, H-27). 13 C-NMR (CD 3 OD, 125 MHz) δ (ppm): 39,07 (C-1), 68,92 (C-2), 68,55 (C-3), 33,27 (C-4), 52,76 (C-5), 206,64 (C-6), 122,72 (C-7), 165,70 (C-8), 42,92 (C-9), 39,90 (C-10), 69,49 (C- 11), 43,77 C-12), 49,00 (C-13), 84,86 (C-14), 31,83 (C-15), 21,51 (C-16), 50,27 (C-17), 18,87 (C-18), 24,61 (C-19), 77,75 (C-20), 20,97 (C-21), 77,94 (C-22), 30,47 (C-23), 37,64 (C-24), 29,21 (C-25), 23,41 (C-26), 22, 75 (C-27). Hợp chất KG1: Amentoflavone (+)-ESI-MS: m / z = 539 [M+H] + ; (-) ESI-MS m / z = 537 [M-H] - ; CTPT: C 30 H 18 O H-NMR (DMSO-d 6, 500 MHz) δ (ppm): 6,77 (s, H-3), 6,15 (br s, H-6), 6,30 (br s, H-8), 8,26 (d, J = 2,0, H-2 ), 6,89 (d, J = 8,5, H-5 ), 7,89 (dd, J = 2,0; 8,5, H-6 ), 6,68 (s, H-3 ), 6,03 (s, H-6 ), 7,67 (d, J = 9,0, H-2 ), 6,55 11

14 (d, J = 9,0, H-3 ), 6,55 (d, J = 9,0, H-5 ), 7,67 (d, J = 9,0, H-6 ). 13 C-NMR (DMSO-d 6, 125 MHz) δ (ppm): 164,56 (C-2), 101,90 (C-3), 181,59 (C-4 ), 161,39 (C-5), 161,39 (C-6), 163,90 ( C-7), 93,93 (C-8), 93,93 (C-9), 103,51 (C- 10), 117,95 (C-1 ), 126,46 (C-2 ), 123,50 (C-3 ), 160,46 (C-4 ), 119,19 (C-5 ), 131,33 (C-6 ), 162,77 (C-2 ), 102,38 (C-3 ), 181,51 (C-4 ), (C-5 ), 101,57 (C-6 ), 160,54 (C-7 ), 106,87 ( C-8 ), 106,87 ( C-9 ), 101,73 (C-10 ), 121,76 (C-1 ), 128,08 (C-2 ), 115,45(C-3 ), 160,46 (C-4 ), 115,45 (C- 5 ), 128,08 (C-6 ). Hợp chất KG2: 4 -O-methylamentoflavone (podocarpus flavone A) (+) ESI-MS: m / z = 575 [M+Na] +, 553 [M+H] + ; (-) ESI-MS: m / z = 551 [M-H] - ;CTPT: C 31 H 20 O H-NMR [(CD 3 ) 2 CO, 500 MHz] δ (ppm): 6,73 (s, H- 3), 6,24 (d, J = 2,0, H-6), 6,51 (d, J = 2,0, H-8), 8,11 (d, J = 2,5, H-2 ), 7,2 6 (d,j = 8,5, H-5 ), 8,04 (dd, J = 2,5; 8,5, H- 6 ), 6,71 (s,h-3 ), 6,46 (br s, H- 6 ), 7,73 (d, J = 9,0,H-1 ), 6,94 (d, J = 9,0,H-3 ), 6,94 ( d, J = 9,0, H- 5 ), 7,73 (d, J = 9,0,H-6 ), 13,01 (s, OH-5 ), 13,15 (s, OH-5), 3,.81 (s,och 3-4 ). 13 C-NMR [(CD 3 ) 2 CO, 125 MHz] δ (ppm): 164,76 (C-2), 104,19 (C-3), 183,45 (C-4), 162,77 (C-5), 99,78 (C-6), 165,05 (C-7), 94,77 (C-8), 160,24 (C-9), 104,33 (C-10), 120,82 (C-1 ), 132,58 (C2 ), 124,28 (C-3 ), 162,77 (C-4 ), 117,48 (C-5 ), 12 8,84 (C-6 ), 165,05 (C-2 ), 104,33 (C-3 ), 183,06 (C-4 ), 162,34 (C-5 ), 104,19 (C-6 ), 162,77 (C-7 ), 105,34 (C-8 ), 158,80 (C-9 ), 104,19 (C-10 ), 123,40 (C-1 ), 128,91 (C-2 ), 115,27 (C- 3 ), 163,60 (C-4 ), 115,27 (C-5 ), 128,91 (C-6 ), 55,89 ( OCH 3-4 ). Hợp chất KG3: 4,4,7 -trimetoxyamentoflavone (+) HR-ESI-MS: m / z = 581,1415. CTPT: C 33 H 24 O H-NMR (CDCl 3 + CD 3 OD, 500 MHz) δ (ppm): 6,61 (s, H-3 ), 6,28 ( br s,h-6), 6,41 (br s,h-8), 7,86 (d, J = 2,5, H-2 ), 7,18 (d, J = 9,0, H-5 ), 8,00 (dd, J = 2,5; 9,0, H-6 ), 6,61 (s,h-3 ), 6,55 (s,h-6 ), 7,48 (d, J = 9,0, H-2 ), 6,84 (d, J = 9,0,H- 3 ), 6,84 (d, J = 9,0,H-5 ), 7,48 (d, J = 9,0, H-6 ), 3,89 (s OCH 3 ), 3,81 (s OCH 3 ), 3,80 (s OCH 3 ). 13 C-NMR(CDCl 3 +CD 3 OD, 125 MHz) δ (ppm): 163,98 (C-2), (C-3), 182,84 (C-4), 161,64 (C-5), 99,10 (C- 6), 164,02 ( C- 7), 94,18 (C- 8), 157,82 (C- 9), 104,35 (C-10), 121,64 (C-1 ), 130,78( C-2 ), 123,12 (C- 3 ), 160,51 (C-4 ), 111,04 (C-5 ), 127,92 (C-6 ), 164,02 (C- 2 ), 12

15 102,97 (C-3 ), 182,28 (C-4 ), 161,40 (C-5 ), 104,66 (C-6 ), 162,69 (C-7 ), 95,20 (C-8 ), 153,97 (C-9 ), 104,75 (C-10 ), 122,94 (C-1 ), 127,61 (C- 2 ), 114,27 (C-3 ), 162,50 (C-4 ), 114,27 (C-5 ), 127,61 (C-6 ), 56,02 (OCH 3 ), 55,15 (OCH 3 ), 55,65 (OCH 3 ). Hợp chất KG4: 3β-hydroxytotarol Phổ (+) ESI-MS có một pic tại m / z = 285,2 (100, [M + H-H 2 O] + ); CTPT: C 20 H 30 O 2. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 1,49 (td, J = 13,1; 4,3, H-1α), 2,25 (dt, J = 13,1; 3,3, H-1β), 1,7-1,8 (m, H-2), 3,29 (dd, J = 11,3; 6,5, H-3), 1,25 (dd, J = 12,4; 2,0, H-5), 1,71 (m, H-6), 2,97 (dd, J = 17,1; 6,4, H-7α), 2,75 (m, H-7β), 6,96 (d, J = 8,5, H-11), 6,51 (d, J = 8,5, H-12), 3,26 (m, H-15), 1,33 (d, J = 7,0, H-16), 1,34 (d, J = 7,0, H-17), 1,07 (s, H-18 ), 0,89 (s, H-19), 1,18 ( s, H- 20). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 37,74 (C-1), 28,15 (C-2), 78,85 (C- 3), 38,79 (C-4), 49,05 (C-5), 19,13 (C-6), 29,05 (C-7), 133,8 (C-8), 142,26 (C-9), 37,51 (C-10), 123,0 (C-11), 114,42 (C-12), 152,23 (C-13), 131,07 (C-14), 27,26 (C-15), 20,29 (C-16), 20,29 (C-17), 15,32 (C-18), 28,12 (C-19), 25,16 (C-20). Hợp chất KG5: Totarol-19-cacboxylic acid Phổ (-) ESI-MS cho thấy một pic ion giả phân tử tại m / z 315,12 ([M-H] - ). CTPT: C 20 H 28 O 3. 1 H-NMR(CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 1,05 (dd, J = 13,5; 4,2, H-1α), 1,93-2,04 (m, H-1β), 1,42 (br d, J = 11,9, H-2α), 1,57-1,61 (m, H-2β), 0,98 (m, H-3α), 1,93-2,04 (m, H-3β), 1,35 (m, H-5), 1,29 (m, H-6α), 2,18 2,25 (m, 6β), 2,62-2,69 (m, H-7α), 2,95 ( dd, J = 4,8; 16,7, H-7β), 6,98 (d, J = 8,5, H-11), 6,51 (d, J = 8,5, H-12), 3,25-3,31 (m, H-15), 1,33 ( d, J = 7,1, H-16), 1,34 ( d, J = 7,1, H-17), 1,12 (s, H-18), 1,33 (s, H-20). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 40,12 (C-1), 20,05 (C-2), 37,22 (C-3), 43,76 (C-4), 52,08 (C-5), 21,10 (C-6), 30,00 (C-7), 134,28 (C-8), 140,99 (C-9), 38,52 (C-10), 124,14 (C- 11), 114,58 (C-12), 152,05 (C-13), 130,88 (C-14), 27,26 (C-15), 20,30 (C-16), 20,40 (C-17), 28,61 (C-18), 183,92 (C-19), 23,20 (C-20). Hợp chất KG6: Ferruginol (+) ESI-MS: m / z 287 [M+H] + cho CTPT: C 20 H 30 O. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 6,63 (s, H-11), 6,83 (s, H-14), 3,1 (sept, J = 6,9, H-15), 1,22 (d, J = 7,0, H-16), 1,23 (d, J = 7,0, H-17), 0,91 (s, H-18), 0,94 (s, H-19), 1,17 (s, H-20). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 38,87 (C-1), 19,23 (C-2), 41,69 13

16 (C-3), 33,44 (C-4), 50,35 (C-5), 19,32 (C-6), 29,76 (C-7), 127,30 (C-8), 148,67 (C-9), 37,51 (C-10), 110,97 (C-11), 150,67 (C-12), 131,37 (C-13), 126,62 (C- 14), 26,81 (C-15), 22,75 (C-16), 22,56 (C-17), 33,32 (C-18), 21,62 (C-19), 24,80 (C-20). Hợp chất KG7: Sugiol (+) ESI-MS: m / z = 301 [M+H] + CTPT: C 20 H 28 O 2. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 1,74 (dd, J = 4,0, H-6), 6,78 ( s, H-11), 7,65 (s, H-14), 3,14 (m, H-15), 1,13 (d, J =7,0, H-16), 1,15 (d, J =7,0 H-17), 0,88 (s, H-18 ), 0,94 (s, H-19), 1,15 (s, H-20). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 37,41 (C-1), 18,48 (C-2), 40,80 (C-3), 32,24 (C-4), 49,05 (C-5), 35,46 (C-6), 196,44 (C-7), 122,52 (C-8), 155,77 (C-9), 37,41 (C-10), 109,28 (C-11), 160,05 (C-12), 132,46 (C-13), 124,95 (C-14), 26,01 (C-15), 22,15 (C-16), 22,81 (C-17), 32,24 (C-18), 21,08 (C-19), 22,97 (C-20). Hợp chất KG8: Nagilactone B (+) HR-ESI-MS: m / z 387,1409 (100%, C 19 H 24 O 7 Na, và 365,1587 (90%, [M + H] +. Phổ MS / MS 2 của đỉnh m/z chứa một đỉnh ở m / z 347,1483 (100, C 19 H 23 O 6 [M+H-H 2 O] +. CTPT là C 19 H 24 O 7. 1 H-NMR (CD 3 ODd 6, 500 MHz) δ (ppm): 4,04 (d, J = 7,3, H-1), 3,88 (m, H-2), 2,24 ( t, J = 13,3, H-3α), 1,76 ( dd, J = 4,6; 5,0, H-3β), 1,88 ( d, J = 6,6, H-5), 4,99 (dd, J = 6,8; 8,4, H-6), 5,29 (d, J = 8,4, H-7), 6,46 (s, H-11), 3,28 (1H, hept., J = 6,8, H-15), 1,25 (d, J = 6,8, H-16), 1,33 ( d, J = 6,8, H-17), 1,42 (s, H-18), 1,45 (s, H-20). 13 C-NMR (CD 3 OD, 125 MHz) δ (ppm): 69,98 (C-1), 64,50 (C-2), 33,19 (C-3), 42,26 (C-4), 46,39 (C-5), 74,31 (C-6), 59,32 (C-7), 110,18 (C-8), 170,42 (C-9), 41,55 (C-10), 106,81 (C-11), 163,6 (C-12), 165,69 (C-14), 29,05 (C-15), 19,99 (C-16), 20,01 (C-17), 23,30 (C-18), 181,48 (C-19), 17,55 (C-20). Hợp chất KG9: 5 -hydroxystigmastane-6-one-3β-hexadecanoate ESI-MS (ion dương) m / z 707 [M+Na] +, 427 [M-C 16 H 31 O-H 2 O] + ; ESI-MS (ion âm) m / z 719 [M+Cl] -, CTPT C 45 H 80 O 4. 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz) δ (ppm): 5,04 (1H, m, H-3), 2,25 (2H, t, J = 7,5, H-4), 0,64 (3H, s, H-18), 0,82 (3H, s, H-19), 0,88 (t, J = 7,0, H-21), 0,82 (3H, d, J = 6,0, H-26), 0,81 (3H, d, J = 6,0, H-27), 0,84 (t, J = 7,0). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz) δ (ppm): 34,69 (C- 1), 32, (C-2), 80,39 (C-3), 37,34 (C-4), 70,29 (C-5 ), 212,21 (C-6 ), 41,77 (C-7),, 14

17 44,33 (C-9), 42,54 (C-10), 21,46 (C-11), 39,58 (C-12), 43,14 (C-13), 56,33 (C- 14), 22,79 (C-15), 27,55 (C-16), 56,07 (C-17), 11,58 (C-18), 14,23 (C-19), 36,13 (C-20), 18,16 (C-21), 33,89 (C-22), 23,76 (C-23), 45,84 (C-24), 28,10 (C-25), 19,04 (C-26), 19,82 (C-27), 22,70 (C-28), 11,98 (C-29). Hợp chất KG10: 2-(4-hydroxyphenyl)-propan-1,3-điol (+) ESI-MS: m / z 169 [M+H] +, 151 [ M+H-H 2 O] +, 133 [M+H-2H 2 O] +. CTPT C 9 H 12 O 3. 1 H-NMR (δ ppm, CD 3 OD): 2,88 (1H, quin, J = 7,0 Hz, H-2 ); 3,74 (2H, dd, J = 6,5; 11,0 Hz, 2H-1); 3,83 (2H, dd, J = 7.0, 11.0 Hz, 2H-3); 6.75 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3, H-5 ) ; 7,09 ( 2H, d, J = 9,0 Hz, H-2, H-6 ). 13 C- NMR (CD 3 OD, δ ppm): 51, 19 (C-2); 65, 20 (C-1, C-3); 130,18 (C-2, C-6 ); 116,21 ( C-3, C-5 ); 132,84 (C-1 ); 157,15 (C-4 ). Hợp chất KG11: -Sitosterol 1 H-NMR (CDCl 3, 500 MHz), (ppm): 5,38-5,36 (1H, m), 3,56-3,52 (1H, m), 2,33-2,25 (2H, m), 2,05-1,97 (2H, m), 1,89-1,82 (3H, m), 1,70-1,65 (2H, m), 1,54-1,11 (24H, m), 1,07 (3H, s), 1,00 (3H, d, J = 6,7 Hz), 0,87 (3H, t, J = 7,1 Hz), 0,86 (6H, br s), 0,70 (3H, s). 13 C-NMR (CDCl 3, 125 MHz), (ppm): 140,79; 121,72; 71,82; 56,80; 56,10; 50,17; 45,88; 42,35; 42,33; 39,81; 37,28; 36,53; 36,16; 33,98; 31,93; 31,69; 29,20; 28,26; 26,14; 24,32; 23,10; 21,11; 19,82; 19,41; 19,06; 18,80; 12,00; 11, Thăm dò hoạt tính sinh học Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH. Sử dụng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) tạo ra gốc oxy hóa tự do được dùng để sàng lọc các chất chống oxy hóa Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm màu bằng Sulforhodamine B (SRB) Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số được tách chiết từ lá hoặc vỏ 3 loài Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả, Kim giao núi đất bằng phương pháp của Porebski và cộng sự (1997) Phương pháp nhân bản sản phẩm PCR_ISSR và PCR_SSR. 15

18 Phản ứng nhân bản gen được thực hiện trên máy PCR system 9700 (Hoa Kỳ) với tổng thể tích 25 µl gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR 1X; MgCl 2 2,5 mm; dntps 2 mm; mồi 100 nm; 50ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase Phân tích số liệu phân tử Các thông số đa dạng di truyền ở mức độ quần thể và loài như: số alen trung bình trên một locus (Na), số alen hiệu quả trên một locus (Ne), phần trăm lô cút đa hình (PPB), chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He), được xác định cho cả chỉ thị ISSR và SSR bằng phần mềm GenAlex 6.3 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Về hóa học và hoạt tính sinh học Hoạt tính sinh học của các dịch chiết Hoạt tính chống oxi hóa Cả 3 dịch chiết từ lá của loài Kim giao núi đất là n-hexane, ethyl acetate và methanol thử hoạt tính chống oxi hóa bằng việc đo khả năng triệt tiêu gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Kết quả cho thấy các dịch chiết này không thể hiện hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính gây độc tế bào Tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 dịch chiết là dịch chiết Hoàng đàn giả tổng (HĐT) và dịch chiết EtOAc (HĐE) trên 4 dòng tế bào ung thư là MCF7, LU-1, Hep-G2, KB. Kết quả cho thấy dịch chiết HĐE thể hiện hoạt tính khá với giá trị IC 50 = 25,21 41,21µg/ml. Dịch chiết HĐT chưa thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư ở các nồng độ thử nghiệm Xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch tách được từ 3 loài lá kim DT2. Cephalotaxine DT3 16

19 DT1 Cephalotaxine β-n-oxide Desoxyharringtonine DT4.Nordesoxyharringtonine DT5.1: Isoharringtonine DT5.2 Norisoharringtonine DT6. 3epischellhammericine DT7 Manniicine DT8 harringtonolide DT9 Epicatechin DT10 Epigallocatechin Các chất phân lập từ loài Đỉnh tùng (C. mannii) 17

20 HĐ1 Acid Lambertic HĐ2 Dacrydianon HĐ3 Daucosterol HĐ4 Ponasterone A HĐ5 20-hydroxyecdysone HĐ6 Ajugasterone C Các chất phân phân lập từ loài Hoàng Đàn giả (D. elatum) KG1: Amentoflavone KG2 : 4 -O-metylamentoflavone KG3: 4,4,7 - trimethoxyamentoflavone KG4: 3βhydroxytotarol KG5: Acid totarol- 19-cacboxylic KG6: Ferruginol KG7: Sugiol KG8: Nagilacton B 18

21 KG9: 5 -hydroxy stigmastane-6-one-3βhexadecanoat KG10: 2-(4- hydroxyphenyl)- propan-1,3-điol KG11: β-sitosterol Cấu trúc các chất phân lập từ loài Kim giao núi đất (N. wallichiana) Hoạt tính sinh học của các chất sạch phân lập từ 3 loài lá kim Hoạt tính chống oxi hóa Hợp chất DT4 (Nordesoxyharringtonine) được đánh giá khả năng quét gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl. Kết quả cho thấy hợp chất này có hoạt tính chống oxi hóa nhưng không mạnh với giá trị IC 50 = 98,1 g / ml. Bốn hợp chất sạch là KG1, KG4, KG7 và KG9 đại diện cho ba lớp chất là biflavone, diterpenoid, steroid phân lập được từ loài Kim giao núi đất được tiến hành thử hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH. Kết quả thử hoạt tính cho thấy các chất sạch từ loài Kim giao núi đất không thể hiện khả năng triệt tiêu gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Hoạt tính gây độc tế bào Hợp chất Nordeoxyharringtonine (DT4) chưa được nghiên cứu nhiều về hoạt tính gây độc tế bào mới chỉ có báo cáo về hoạt tính ức chế tế bào bạch cầu ở chuột [24]. Vì vậy khi phân lập được hợp chất này từ loài Đỉnh tùng (C. mannii) chúng tôi đã chú ý tới việc tiếp tục nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của chất này đối với các dòng tế bào ung thư khác là tế bào ung thư phổi (Lu), ung thư biểu mô miệng (KB), ung thư vú (MCF7) và ung thư gan (Hep-G2). Kết quả cho thấy hợp chất DT4 thể hiện hoạt tính mạnh đối với cả 4 dòng tế bào thử nghiệm. Cụ thể là đối với dòng tế bào ung thư KB chất DT4 thể hiện hoạt tính chống tế bào ung thư mạnh gấp 21 lần chất đối chứng, với dòng tế bào ung thư phổi Lu-1 mạnh gấp 91,5 lần, với tế bào ung thư gan HepG2 mạnh gấp 8,9 lần và đặc biệt hoạt tính chống tế bào ung thư vú MCF7 mạnh gấp 107,5 lần ellipticine. Các hợp chất phân lập được từ dịch EtOAc của loài Hoàng đàn giả đã được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào đối với bốn dòng tế bào ung thư Bảng Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập từ loài Hoàng đàn giả 19

22 ST Hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC 50 ( M) Kí hiệu T KB Lu-1 HepG2 MCF7 mẫu 1 HĐ1 162,53 ± 9,75 167,03 ± 19,75 224,24 ± 22,03 184,97 ± 17,28 2 HĐ4 185,63 ± 11,47 209,40 ± 15,65 135,50 ± 11,70 147,28 ± 17,56 3 HĐ5 194,02 ± ,60 ± 8,33 199,85 ± 6,70 206,52 ± 16,56 4 HĐ6 > 100* > 100* > 100* > 100* 5 Ellipticine 1,79 ± 0,12 1,50 ± 0,16 1,26 ± 0,16 1,30 ± 0,24 * Các chất không có hoạt tính và không qui đổi ra ( M) Đây là các kết quả nghiên cứu lần đầu tiên về hoạt tính sinh học của các dịch chiết và các chất sạch phân lập được từ cây Hoàng đàn giả Năm hợp chất phân lập được từ Kim giao núi đất là KG5, KG8, KG9, KG10 và KG11 đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên tám dòng tế bào ung thư ở người với ellipticine là đối chứng dương. Các kết quả được thể hiện trong bảng Bảng Hoạt tính gây độc tế bào của các chất KG1, KG4, KG5, KG8 và KG9 Chất Hep G2 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC 50 ( M) KB LU-1 MCF7 SK- Mel2 HL60 SW626 SW480 KG8 13,71 8,30 14,51 16,40 15,36 7,42 16,84 13,85 KG4 289,34 305,79 264,27 262,35 302,55 276,19 314,47 288,47 KG9 >100 * >100 * >100 * >100 * >100 * >100 * >100 * >100 * KG5 130,82 149,34 114,59 107,37 148,04 107,88 126,2 107,85 KG1 >100 * >100 * >100 * >100 * >100 * >100 * >100 * >100 * Ellipticine 1,67 1,87 1,38 1,54 1,79 1,75 1,59 1,67 * Các chất có giá trị IC 50 > 100 μg/ml được xem như không có hoạt tính và không qui đổi ra ( M) Đây là công bố đầu tiên về hoạt tính chống ung thư của các hợp chất được phân lập từ loài Kim giao núi đất Mức độ thay đổi phân tử giữa và trong quần thể của 3 loài lá kim Tổng số 79 chỉ thị (44 chỉ thị ISSR và 35 chỉ thị SSR) đã được sử dụng để đánh giá tính đa dạng di truyền cho 3 loài lá kim ở Tây Nguyên là Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả và Kim giao núi đất. Trong đó, số lượng chỉ thị dùng để phân tích cho 20

23 loài Kim giao núi đất là cao nhất (48 chỉ thị), thứ hai là loài Hoàng đàn giả (47 chỉ thị) và thấp nhất là loài Đỉnh tùng (37 chỉ thị). Bảng Một số thông số di truyền của 3 loài lá kim phân tích tổ hợp với hai chỉ thị ISSR và SSR Loài N Na Ne I He h Đỉnh tùng (C. mannii) Hoàng đàn giả (D. elatum) Kim giao núi đất (N.wallichiana) 21 PPB (%) *Fis 34 1,656 1,470 0,382 0,262 0,218 65,65-0, ,685 1,351 0,318 0,209 0,192 68,54-0, ,748 1,570 0,445 0,309 0,262 74,79 0,333 Ghi chú: Na: số alen quan sát trung bình trên một locus; Ne: số alen hiệu quả trên một locus; I: chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon; He: hệ số gen di hợp tử mong đợi; h: chỉ số đa dạng di truyền theo Nei; PPB: phần trăm phân đoạn đa hình; *Fis: hệ số giao phấn cận noãn với p < 0,05 (số liệu chỉ xác định cho chỉ thị SSR). Kết quả phân tích các thông số di truyền của 3 loài lá kim đã chỉ ra loài Kim giao núi đất có tính đa dạng di truyền cao nhất (Na = 1,748; Ne = 1,570; I = 0,445; He = 0,309; h = 0,262 và PPB = 74,79%); thứ hai là loài Đỉnh tùng (Na = 1,656; Ne = 1,470; I = 0,382; He = 0,262; h = 0,218 và PPB = 65,65%) và thấp nhất là Hoàng đàn giả (Na = 1,685; Ne = 1,351; I = 0,318; He = 0,209; h = 0,192 và PPB = 68,54%) (Bảng 3.28). KẾT LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Thành phần hóa học của 3 loài lá kim Từ loài Đỉnh tùng (C. mannii) Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 11 hợp chất từ các bộ phận lá, cành và vỏ loài Đỉnh tùng (C. mannii), bao gồm 8 hợp chất alkaloid có khung cephalotaxine (6/8) và khung homoerythrina (2/8) đặc trưng cho chi Cephalotaxus, 2 hợp chất flavonoid và 1 hợp chất norditerpenlactone. Trong đó có một alkaloid mới là norisoharringtonine (DTV5.2). Đây là lần đầu tiên các hợp chất này được phân lập từ loài Đỉnh tùng (C. mannii). Đã bổ sung một số dữ liệu phổ 13 C NMR chưa có trong tài liệu của hai alkaloid là 3-Epischellhammericine (DT6) và isomer của nó được đặt tên là Manniicine (DT7). Từ loài Hoàng đàn giả (D. elatum)

24 Lần đầu tiên 6 hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ vỏ thân và cành của loài Hoàng đàn giả (D. elatum) gồm 2 hợp chất diterpenoid, 3 hợp chất thuộc nhóm ecdysteroid và 1 phytosteroid glucosid (daucosterol). Trong đó có một diterpene mới đặt tên là dacrydianon (HĐ2). Từ loài Kim giao núi đất (N. wallichinana) Lần đầu tiên từ loài Kim giao núi đất (N. wallichiana) và chi Nageia đã phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất bao gồm 3 hợp chất biflavonoid, 5 hợp chất diterpenoid, 2 hợp chất thuộc nhóm phytosterol, 1 hợp chất phenolic. Đã bổ sung một số dữ liệu phổ 13 C NMR chưa có trong tài liệu của các chất là 3β-hydroxytotarol (KG4), Totarol-19-carboxylic acid (KG5), Ferruginol (KG6) 2. Hoạt tính sinh học của 3 loài lá kim Năm dịch chiết thô và 11 chất sạch chọn lọc đã được thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào. Kết quả cho thấy + Hoạt tính kháng oxy hóa: Các dịch chiết và chất sạch hầu như không thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa. + Hoạt tính gây độc tế bào: Alkaloid nor-deoxyharringtonine (DT4) thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư rất mạnh đối với cả 4 dòng tế bào thử nghiệm là KB, HepG2, MCF7 và Lu-1 với giá trị IC 50 từ 0,02-0,16 μm. Hợp chất Nagilacton B (KG8) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh với cả 8 dòng tế bào thử nghiệm với các giá trị IC 50 từ 7,42-16,84 μm. Điều thú vị là hoạt tính của chất KG8 đối với các dòng tế bào HL60 (IC 50 7,42 M); KB (IC 50 8,3μM) và HepG2 (IC 50 13,71 M) là khá cao nên cần được tiếp tục nghiên cứu. Các hợp chất khác thể hiện hoạt tính yếu. Tổng số 28 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ 3 loài nghiên cứu gồm Đỉnh tùng (C. mannii), Hoàng đàn giả (D. elatum) và Kim giao núi đất (N. wallichiana) được thu hái tại Tây Nguyên, Việt Nam. Trong đó có 2 chất có cấu trúc mới. Năm dịch chiết và 10 chất sạch đã được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào. Trong đó có 5 hợp chất thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư đối với các dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Đáng chú ý là 2 hợp chất Nagilacton B (KG8) cho thấy khả năng ức chế mạnh sự phát triển của cả 8 dòng tế bào ung thư (KB, HepG2, MCF7, Lu-1, HL60, SK-Mel2, SW626, SW480) đặc biệt là dòng tế bào ung thư cổ tử cung HL60 (IC 50 7,42 μm), ung thư gan KB (IC 50 8,30 M) và hợp chất Nordeoxyharringtonine (DT4) thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh hơn chất đối chứng trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm đặc biệt là tế bào ung thư vú MCF7 cao gấp 107,5 lần chất đối chứng. 3. Tính đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim Kết quả phân tích các thông số di truyền đã chỉ ra loài Kim giao núi đất có tính đa dạng di truyền cao nhất (Na = 1,748; Ne = 1,570; I = 0,445; He = 0,309; h = 0,262 và PPB = 74,79%); thứ hai là loài Đỉnh tùng (Na = 1,656; Ne = 1,470; I = 0,382; He = 0,262; h = 0,218 và PPB = 65,65%) và thấp nhất là Hoàng đàn giả (Na = 1,685; Ne = 1,351; I = 0,318; He = 0,209; h = 0,192 và PPB = 68,54%). Hai loài Đỉnh tùng và Hoàng đàn giả đều có hiện tượng trao 22

25 đổi chéo cao (giá trị Fis< 0). Quần thể của cả 3 loài cây này đều là những cây tái sinh từ hạt, sống trong cùng môi trường địa lý, địa chất như nhau, nên cho phép khẳng định sự bảo tồn của các lớp chất hóa học của mỗi loài. Đây là những cơ sở khoa học cho việc bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen loài lá kim này ở Tây Nguyên. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ các bộ phận khác của 3 loài nghiên cứu như rễ, gỗ thân để có những đánh giá toàn diện hơn về 3 loài này. 2. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học một số hợp chất có hoạt tính từ 3 loài nghiên cứu, tìm ra mối tương quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học. 3. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và tính đa dạng di truyền nguồn gen chúng tôi có đề xuất với các nhà nghiên cứu và các cơ quan chức năng cần có chiến lược bảo tồn, phát triển và khai thác nguồn nguyên liệu từ ba loài Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả và Kim giao núi đất ở Lâm Đồng để một ngày không xa Việt Nam có thể phát triển một số loài thuốc có giá trị trong y học. 23

26 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Kim giao núi đất (N. wallichiana) được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới. Mười một hợp chất được phân lập từ loài này, 5/11 hợp chất đã được thử hoạt tính gây độc tế bào. Đã tìm được hợp chất Nagilacton B (KG8) có hoạt tính mạnh đối với 8 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, giá trị IC 50 dao động từ 7,42-16,84 μm. Đây là kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đầu tiên được báo cáo từ chi Nageia. 2. Lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Đỉnh tùng (C. mannii) được nghiên cứu ở Việt Nam. Mười một hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ loài này trong đó có một chất có cấu trúc mới là norisoharringtonine (DT.5.2). Hợp chất nordeoxyharringtonine (DT4) thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh gấp nhiều lần chất đối chứng trên cả 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (KB, HepG2, MCF7, Lu-1). 3. Sáu hợp chất lần đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc từ loài Hoàng đàn giả (D. elatum). 4/6 hợp chất sạch được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào. 4. Lần đầu tiên ở Việt Nam 3 loài lá kim Đỉnh tùng (C. mannii), Hoàng đàn giải (D. elatum) và Kim giao núi đất (N. wallichiana) được nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen di truyền bằng 2 chỉ thị ISSR và SSR nhằm phục vụ công tác bảo tồn các loài cây lá kim- một loài cây có giá trị của Tây nguyên, Việt Nam. 24

27 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Tran Van Loc, Nguyen Thi Lieu, Tran Thi Phuong Thao, Nguyen Thi Luu, Ho Ngoc Anh, Le Thi Thu Ha, Tran Van Chien, Pham Thi Ninh, Dinh Thi Phòng, Tran Van Sung, The Alkaloidal constituents of Cephalotaxus mannii collected in LAM DONG province, Viet Nam, Chemistry of nature compound, 2017, 53 (6), Nguyen Thi Lieu, Tran Van Loc, Tran Thi Phuong Thao, Nguyen Thi Luu, Ho Ngoc Anh, Le Thi Thu Ha, Tran Van Chien, Pham Thi Ninh, Dinh Thi Phòng, Tran Van Sung, The non-alkaloidal constituents of Cephalotaxus mannii, collected in LAM DONG province, Vietnam, Journal of Chemistry, 2016, 54 (2 ), Nguyễn Thị Liễu, Phạm Thị Ninh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Thị Lưu, Trần Văn Lộc, Đinh Thị Phòng, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Sung, Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài Kim giao núi đất ( Nageia wallichiana ) thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, phần 1. Các hợp chất diterpnoid, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (1), Nguyễn Thị Liễu, Phạm Thị Ninh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Nguyễn Thị Lưu, Trần Văn Lộc, Đinh Thị Phòng, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Chiến, Trần Văn Sung, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Kim giao núi đất thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam, phần 2. Các hợp chất biflavonoid, steroid và phenolic, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (3), Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Trần Thị Việt Thanh, Nguyễn Quốc Bình, Vũ Đình Duy, Nguyễn Tiến Hiệp, Phạm Hữu Nhân, Đánh giá đa dạng di truyền quần thể tự nhiên loài Kim giao núi đất (Nageia wallichiana (C. Presl) Kuntze) ở Tây Nguyên bằng chỉ thị ISSR, tạp chí công nghệ Sinh học, 2015, 13 (1), Trần Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Liễu, Đinh Thị Phòng, So sánh hiệu quả của chỉ thị ISSR và SSR trong đánh giá đa dạng di truyền quần thể Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) tự nhiên ở Tây Nguyên, Việt Nam, tạp chí Công nghệ sinh học, 2017, 15(2),