NH H NG C A CÁC Y U T CÔNG NGH CHÍNH N KH N NG TRÍCH LY 1- DEOXYNOJIRIMYCIN (DNJ) T LÁ DÂU T M VI T NAM Hoàng Th L H ng 1, Nguy n Minh Châu 1, Nguy n Th Di u Thúy 1 TÓM T T T tiêu c a nghiên c u này là xác nh các thông s k thu t t i u c a quá trình trích ly nh m thu c hi u su t trích ly DNJ cao nh t t gi ng dâu Qu hi n ang c tr ng ph bi n t i Vi t Nam. H p ch t DNJ c trích ly t lá dâu t m, gi ng Qu c tr ng t i t nh Thái Bình, Vi t Nam b ng dung môi ethanol 30% c axit hóa b ng axit axetic (v i n ng 1%). Nghiên c u quá trình trích ly các i u ki n nhi t, th i gian và các t l lá dâu khô/dung môi khác nhau nh m xác nh các thông s k thu t t i u cho quá trình trích ly DNJ. K t qu nghiên c u cho th y kh n ng trích ly DNJ t lá dâu t m t hi u qu cao nh t khi quá trình trích ly c ti n hành các i u ki n t i u sau: T l dung môi/ nguyên li u 15/1 trong th i gian trích ly 6 gi nhi t 43 0 C. Các i u ki n này s cho hi u su t trích ly DNJ t 80%. T khóa: DNJ, dâu t m, t i u hóa, trích ly, dung môi trích ly. I. T V N 5 H p ch t 1- deoxynojirimycin (DNJ) là m t alcaloit có ho t tính sinh h c, có ch c n ng ch ng s t ng ng huy t, h tr i u tr và phòng ng a b nh ti u ng. Hi n nay, vi c nghiên c u tách chi t DNJ t lá dâu t m và s d ng trong ch bi n th c ph m ch c n ng ã c ti n hành nhi u n c có truy n th ng tr ng dâu nuôi t m nh Nh t B n, Trung Qu c [8, 10]. Theo ó, m t s s n ph m t lá dâu t m v i tác d ng h tr i u tr b nh ti u ng nh trà túi l c, viên th c ph m ch c n ng ã có m t trên th tr ng các n c này. Bên c nh ó, Vi t Nam c ng là n c có truy n th ng tr ng dâu lâu i v i s n l ng t ng i l n. Vì v y, vi c nghiên c u tách chi t ho t ch t DNJ t lá dâu t m ng d ng trong ch bi n th c ph m ch c n ng dùng cho ng i b b nh ti u ng có ti m n ng r t l n c v nguyên li u và kh n ng ng d ng th c ti n. dù v y, cho n nay v n còn r t ít k t qu nghiên c u c công b trong l nh v c này [3]. II. V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 1. V t V li u Lá dâu thu c gi ng dâu Qu, có già bánh t (lá th 5-1) c thu hái vào v hè t i t nh Thái Bình. Thí nghi m c b trí t i phòng thí nghi m B môn B o qu n Ch bi n - Vi n Nghiên c u Rau qu (Hà N i).. Ph ng pháp nghiên c u c 1 Viện Nghiên cứu Rau quả - nh l ng alcaloit toàn ph n trong th c v t theo D c i n Vi t Nam [1]. - Xác nh DNJ trong lá dâu b ng ph ng pháp t o d n xu t v i 9-fluorenylmethyl cloroformat (FMOC trên h th ng HPLC pha ng c). CL: Ch ng trình ch y c a HPLC: Pha ng trong 0 phút, sau ó r a c t b ng metanol trong 10 phút và sau ó l i tráng c t b ng pha ng trong 15 phút v i thành ph n pha ng g m h n h p n c (b sung 0,% axit formic) và metanol (b sung 0,% axit formic) theo t l 6:4 (v/v). T c ch y: 0,5 ml/phút, lo i c t: YMC Pack ODS (C-18), kích th c h t là 3 µ m. B ph n phát hi n (detector): Hu nh quang v i b c sóng Ex 54/Em 3 nm. - xác nh các giá tr t i u c a các y u t nh h ng (X i ) t i ó quá trình trích ly t hi u qu nh t (hàm m c tiêu Y i kh i l ng DNJ t c c i), các thí nghi m c b trí theo ma tr n Doehlert v i các kho ng bi n i c a các y u t nh sau: Ch tiêu d i gi a trên T l dung môi / nguyên li u 1/1 14/1 16/1 Nhi t trích ly ( 0 C) 30 40 50 Th i gian trích ly( gi ) 18 4 30 Quá trình tính toán và k t qu c x lý b ng máy tính theo ch ng trình NEMROD (New Efficient Methodology For Research Using Optimal Design). - Ki m tra gi thi t th ng kê theo ANOVA b ng ph n m m SAS 9.0. 58
III. K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 1. Nghiên c u c xác nh mi n nh h ng c a c nhi t n kh n ng trích ly DNJ Ti n hành kh o sát kh n ng trích ly DNJ và alcaloit t lá dâu t m các kho ng nhi t khác nhau c a dung môi ethanol 30% ã c axit hóa 1% axit. T k t qu nêu trong b ng 1 th y r ng hi u su t trích ly alcaloit và DNJ t ng t l thu n v i nhi t trích ly, i u này phù h p v i các k t qu nghiên c u c a Vi n Công ngh Th c ph m (Báo cáo t ng k t 007 [5]). Tuy nhiên m c t ng có khác bi t các ng ng nhi t. ng ng nhi t t 30-50 0 C m c t ng c a hi u su t trích ly alcaloit và DNJ gi a các m u chênh l ch nhau r t nhi u. Ng c l i, các ng ng nhi t cao h n (60-70 0 C) thì m c chênh l ch c a các giá tr này không áng k và th m chí còn có xu h ng gi m nh. i u này có th do nh h ng c a l ng pectin hòa tan t lá dâu vào d ch chi t t ng lên gây khó kh n cho quá trình trích ly alcaloit và DNJ. T l DNJ /alcaloit có trong d ch trích ly lá dâu nhìn chung l gi m d n theo chi u t ng c a nhi t trích ly, nh ng m c gi m không nhi u. i u này là do nhi t cao, m t l ng l n alcaloit khác nh sáp, nh a, clorophyl c chi t ra nhi u h n so v i khi nhi t th p. C ng theo k t qu thu c cho th y v i m c ích thu nh n DNJ thì vi c trích ly các ng ng nhi t th p s cho d ch trích ly có t l DNJ cao h n. H n n a, khi trích ly các nhi t th p s ít t n n ng l ng nên hi u qu kinh t s cao h n. T các nh n xét trên, ã l a ch n mi n nghiên c u nh h ng c a y u t nhi t t 30-50 0 C. B ng 1. nh h ng c a nhi t n kh n ng trích ly DNJ và alcaloit t t lá dâu t m Nhi t trích ly ( 0 C) alcaloit (%) Hi u su t trích ly alcaloit (%) Hi u su t trích ly DNJ (%) T l DNJ/alcaloit 30 0,09 65,3 0,14 c 61,7 68,0 40 0,38 76,3 0,160 b 69,6 67, 50 0,5 78,8 0,168 a 73,0 66,7 60 0,54 79,5 0,168 a 73,0 66,1 70 0,47 77,1 0,167 a 7,8 67,6 m c p<0,05.. Nghiên c u c xác nh mi n nh h ng c a t l s làm cho hi u qu quá trình s n xu t th p, ng nguyên li u/dung môi n kh n ng trích ly DNJ th i t ng chi phí và giá thành s n ph m. Theo lý thuy t, hi u su t trích ly DNJ t l thu n v i t l dung môi/nguyên li u. Tuy nhiên trong th c t trích ly thêm c m t l ng DNJ nh t nh c n ph i s d ng thêm m t l ng dung môi khá l n cùng v i h th ng thi t b có dung tích r t l n, do ó Chính vì v y, xác nh c t l dung môi/nguyên li u thích h p m b o hi u qu kinh t cho quá trình s n xu t th c t ã ti n hành kh o sát quá trình trích ly các t l dung môi khác nhau. B ng. nh h ng c a t l nguyên li u / dung môi n kh n ng trích ly DNJ và alcaloit t lá dâu t m T l ng. li u /dung môi alcaloit (g) H. su t trích ly alcaloit(%) H. su t trích ly DNJ (%) T l DNJ/alcaloit 1/8 0,160 50,1 0,10 d 44,3 63,8 1/10 0,17 53,7 0,110 c 47,8 64 1/1 0,09 65,3 0,14 b 61,7 68,0 1/14 0,8 71,1 0,155 b 67,4 67,8 1/16 0,41 75,3 0,165 a 71,7 68,5 1/18 0,4 76,0 0,167 a 7,6 69,0 m c p<0,05 K t qu c trình bày b ng cho th y kh n ng trích ly t ng áng k so v i các m u c trích n ng trích ly alcaloit và DNJ t ng khi t l nguyên ly t l nguyên li u/dung môi t 1/8-1/10, nh ng li u/dung môi gi m. Trong ó, v i các m u có t l khi t l này gi m n 1/18 thì kh n ng trích ly lá dâu/dung môi trong kho ng 1/1-1/16 có kh ( c th hi n kh i l ng DNJ và alcaloit thu c 59
trong d ch chi t) t ng không áng k so v i m u ngay tr c ó (t l 1/16). Ngoài ra, t l 1/18 tuy kh n ng trích ly t ng không áng k trong khi ph i t n thêm m t l ng dung môi và n ng l ng cô c d ch sau trích ly. C ng t các k t qu thu c cho th y, t l DNJ/alcaloit t ng t l ngh ch so v i t l nguyên li u/ dung môi. i u ó cho th y khi l ng dung môi t ng s không nh ng làm t ng hi u su t trích ly alcaloit và DNJ mà còn t ng tinh s ch c a d ch DNJ. T các nh n xét trên ã l a ch n mi n nghiên c u nh h ng c a y u t t l nguyên li u/dung môi n trích ly DNJ t 1/1-1/16. 3. Nghiên c u c xác nh mi n nh h ng c a th i gian n n kh n ng trích ly DNJ K t qu b ng 3 cho th y kh n ng trích ly (th Th i gian (gi ) hi n qua hi u su t trích ly alcaloit và DNJ) t l thu n v i th i gian trích ly. Tuy nhiên, kh n ng trích ly c a các m u có th i gian trích ly trong kho ng t 6-18 gi không cao và khác nhau không áng k. Trong khi ó, các m u c trích ly th i gian 4 gi và 30 gi cho hi u su t cao h n nhi u. Nh ng khi ti p t c kéo dài th i gian trích ly ( i v i m u có th i gian trích ly 36 gi ) thì hi u su t trích ly tuy có t ng nh ng m c t ng không áng k. Các nh n xét trên cho th y kho ng th i gian nh h ng l n n kh n ng trích ly alcaloit và DNJ t lá dâu t m là 18-30 gi. Trong nghiên c u này ã ch n mi n nh h ng c a th i gian trích ly n hi u su t trích ly alcaloit và DNJ là 18-30 gi. B ng 3. nh h ng c a th i gian n kh n ng trích ly DNJ và alcaloit t lá dâu t m alcaloit (g) Hi u su t trích ly alcaloit (%) Hi u su t trích ly DNJ (%) 6 0,136 4,5 0,081 e 35,5 59,7 1 0,167 5, 0,105 d 45,7 63,3 18 0,193 60,3 0,14 c 54,0 64,4 4 0,09 65,3 0,14 b 61,7 68,0 30 0,5 74,9 0,151 a 65,6 67,1 36 0,6 75,1 0,153 a 66,5 68,0 m c p<0,05 4. T i T u hóa i u ki n trích ly DNJ t lá dâu t m T l DNJ/ alcaloit B ng 4. K t quá các thí nghi m c b trí theo ma tr n Doehlert Bi n mã hóa Bi n s th c K t qu TT T l Nhi t Th.gian X1 X X3 DM / NL trích ly trích ly (h) 1 1 0 0 16 40 4 0,170-1 0 0 1 40 4 0,167 3 0,5 0,866 0 15 48,7 4 0,175 4-0,5-0,866 0 13 31,3 4 0,150 5 0,5-0,866 0 15 31.3 4 0,16 6-0,5 0,866 0 13 48,7 4 0,173 7 0,5 0,88 0,816 15 4.9 8,9 0,183 8-0,5-0,88-0,816 13 37,1 19,1 0,145 9 0,5-0,88-0,816 15 37,1 19,1 0,153 10 0 0,577-0,816 14 45,8 19,1 0,175 11-0,5 0,88 0,816 13 4,9 8,9 0,167 1 0-0,577 0,816 14 34, 8,9 0,170 13 0 0 0 14 40 4 0,185 14 0 0 0 14 40 4 0,184 15 0 0 0 14 40 4 0,185 60
Ti n hành các thí nghi m v i các i m thí nghi m theo ma tr n Doehlert v i các bi n X i c xác nh trong các kho ng gi i h n và k t qu ã c trình bày ph n III.. Các thí nghi m t i u hóa c ti n hành v i 15 i m thí nghi m và thu c các s li u th c nghi m (B ng 4). M i thí nghi m c ti n hành 3 l n v i sai s c a Y là 5%. Sau khi x lý các k t qu th c nghi m trên máy tính b ng ch ng trình NEMROD ã xác nh c giá tr c a l ch chu n t ng i nh (0,00006) và h s t ng quan ( 0,947) 0,7 ch ng t ph ng trình h i quy th c nghi m có tin c y cao. H s f - h s gia t ng là s o tuy t i th hi n tính thích ng c a mô hình trên toàn mi n ã ch n có giá tr t 1,0-1, ch ng t ma tr n ã ch n là hoàn toàn thích ng. T ó ã xác nh c các ph ng trình h i quy th c nghi m i v i i l ng Y kh i l ng DNJ thu c trong quá trình trích ly nh sau: Y = 0,1847 + 0,0055X 1 + 0,013X + 0,0096X 3 0,016X 1 0,008X 0,0195 X 3-0,0058X 1 X + 0,0069 X 1 X 3 0,0165 X X 3. tìm vùng t i u cho quá trình, ã v b m t áp ng c a kh i l ng DNJ thu c (Y) b ng ch ng trình Marlab theo các bi n X i. Hình 1. B B l ng ng DNJ theo t l dung môi / nguyên li u và nhi t trích ly Hình. B B l ng ng DNJ theo t l dung môi / nguyên n li u và th i gian trích ly Hình 3. B B l ng ng DNJ theo nhi t và th i gian trích ly Các b m t áp ng trên th hi n s tác ng t ng tác c a hai y u t ng th i vào kh i l ng DNJ c trích ly. T các hình 1, và 3 ã nh n th y s tác ng c a nhi t và th i gian, th i gian và t l dung môi/ nguyên li u và c a t l dung môi/ nguyên li u và nhi t n trích ly DNJ là r t l n. DNJ cao nh t ng v i kho ng X 1 = -0,-0,5 và X = 0-0,6, t c là kho ng t l dung môi/nguyên li u t 13,5/1-15/1 và nhi t trích ly t 40-46 0 C. DNJ cao nh t ng v i kho ng X 1 = -0,05-0,55 và X 3 = 0-0,6 t c là kho ng t l dung môi/nguyên li u t 14/1-15/1 và th i gian trích ly là 4-7gi. DNJ cao nh t ng v i kho ng X = -0,1-0,55 và X 3 = -0,-0,5, t c là nhi t trích ly t 40-46 0 C và th i gian t 3-6 gi. T ây ã ti n hành gi i bài toán t i u hóa tìm ra i m t i u v i hàm mong i là kh i l ng DNJ =0,185 g. K t qu thu c c trình bày b ng 5 và b ng 6. B ng 5. i m t i u c a các hàm áp ng Bi n Giá tr mã hóa Tên bi n Giá tr bi n th c X 1 0,396798 T l dung môi/nguyên li u 14,8 X 0,33060 Nhi t trích ly 43,3 X 3 0,395673 Th i gian trích ly 6,4 B ng 6. Giá tr t i u c a các hàm áp ng và hàm mong i i Hàm m c tiêu Y - Hàm l ng DNJ Giá tr hàm m c tiêu % hàm mong i H s tr ng l ng 0,185 100,00 1 Mong i 100,00 61
Qua k t qu trên ã nh n th y hàm mong i th a mãn 100% s k v ng. T các vùng t i u thu c trên k t h p v i hi u qu kinh t trong quá trình s n xu t ã l a ch n c các y u t công ngh t i u phù h p v i i u ki n s n xu t th c t là: T l nguyên li u/dung môi =15/1; th i gian trích ly =6 gi ; thi t trích ly = 43 0 C. T ng ng khi ó hàm l ng DNJ thu c là 0,185 g. T các s li u trên ã ti n hành làm thí nghi m ki m ch ng các i u ki n ã xác nh; k t qu thu c kh i l ng DNJ là 0,184 g (s li u r t g n v i tính toán). IV. K T LU N - Các y u t công ngh (nhi t, th i gian, t l nguyên li u/ dung môi) có nh h ng l n n kh n ng trích ly DNJ t lá dâu t m. - Kh n ng trích ly DNJ t lá dâu t m t hi u qu cao nh t là khi trích ly i u ki n: t l dung môi/ nguyên li u 15/1 trong th i gian trích ly 6 gi nhi t 43 0 C, khi ó hi u su t trích ly DNJ t 80%. TÀI LI U THAM KH O 1. B Y t, 00. D c i n Vi t Nam, Hà N i: Dâu (lá).. Lê V n ng, 005. Chuyên m t s h p ch t thiên nhiên. NXB i h c Qu c gia Tp.HCM. 3. Nguy n Quang Trung, 007. ánh giá tác d ng b t chi t lá dâu trên các ch s lipit và tr ng thái ch ng oxy hóa trong máu chu t nh t tr ng gây r i lo n lipit máu và ái tháo ng th c nghi m. T p chí Y h c Th c hành. S 10. 4. Nguy n Minh Châu, 011. Nghiên c u quy trình công ngh s n xu t b t lá dâu t m có ch a hàm l ng ho t ch t ch c n ng DNJ (1- deoxynojirimycin). Lu n v n th c s khoa h c, 49-53. 5. Vi n Công nghi p Th c ph m, 007. Nghiên c u công ngh s n xu t b t lá dâu t m giàu 1- Deoxynojirimycin. Báo cáo t ng k t tài 007. 6. Bondada Andalulua N. Ch., 003. Antioxidant role of mulberry leaves in streptozotocin-diabetic rats. Elsevier, Clinica Chimica Acta. 7. Cockram C. S., T. Van Binh, Gaela G., 007. Diabetes prevention and control in Viet Nam: Demonstration project in two provinces, Global Report. 8. Kimura T., Nagakawa K., Kubota H., Kojima Y. Goto, Y., 007. Food grade mulberry powder enriched with 1-Deoxynojirimycin suppresses the elevation of postprandial blood glucose in humans. Journal of Agricultural and Food chemistry. 55, 5869-5874. 9. Nuengchamnong N., Ingkaninan K., Kaewruang W., Wongareonwanakij S., Hongthongdaeng B., 007. Quantitative determination of 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44, 853 858. 10. Venkatesh Kumar R., Seema C., 008. Mulberry: Life enhancer. Journal of Medicinal Plants Research, (10), 71-78. 11. http://vi.wikipedia.org/wiki/%c4%90%c3%a 1i_th%C3%A1o_%C4%91%C6%B0%E1%BB%9Dng INFLUENCE OF MAIN TECHNOLOGICAL FACTORS UPON 1-DEOXYNOJIRIMYCIN 1 (DNJ) EXTRACTION FROM VIETNAMESE MULBERRY LEAVES Hoang Thi Le Hang, Nguyen Minh Chau, Nguyen Thi Dieu Thuy Summary The objective of this study was to determine the optimal technical parameters to obtain the highest DNJ extraction performance from the mulberry Que crop is widely grown in Vietnam. DNJ compounds were extracted from the mulberry leaves, Que crop is grown in Thai Binh province, Vietnam with 30% ethanol solvent was acidified with acetic acid (with the concentration is 1%). Research in the process of extraction temperature, time and the rate of dried mulberry leaves per various solvents to determine the optimal technical parameters for the DNJ extraction process. Research results show the most effectively potential for extracting DNJ from mulberry leaves is when the extraction is conducted in the following optimal conditions: The rate of solvent/material 15/1, in the extracted time: 6 hours and a temperature at 43 0 C. With these conditions the DNJ extraction efficiency will be reached 80%. Keywords: DNJ, extraction, mulberry leaves, optimalization, extraction solvent. Ng i i ph n bi n: PGS.TS. Nguy n Duy Lâm 6