BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHÍ THỊ ĐÀO TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC ANALOG CỦA BENGAMIDE A VÀ E Chuyên ngành : Hóa hữu cơ Mã số : 62 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2018
Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS.Habil Phạm Văn Cường 2. TS. Đoàn Thị Mai Hương Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ.., ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Thi Dao Phi, Huong Doan Thi Mai, Van Hieu Tran, Bich Ngan Truong, Tuan Anh Tran, Van Loi Vu, Van Minh Chau, Van Cuong Pham. Design, synthesis and cytotoxicity of bengamide analogues and their epimers. Med. Chem. Commun, 2017,8, 445-451. 2. Thi Dao Phi, Huong Doan Thi Mai, Van Hieu Tran, Van Loi Vu, Bich Ngan Truong, Tuan Anh Tran, Van Minh Chau and Van Cuong Pham. Synthesis of bengamide E analogues and their cytotoxic activity. Tetrahedron Letters. 2017, 58, 1830-1833 3. Phi Thi Dao, Doan Thi Mai Huong, Le Thi Phuong, Chau Van Minh, Pham Van Cuong. Synthesis of 8-methyl-2-O-methyl-3,5-O-(1- methyl ethylidene)-6,7,8,9-tetradeoxy-d-gulo-6-nonenonic acid (6E)- - lactone. Vietnam Journal of Chemistry, 2015,53 (2e), 154-157 4. Phi Thi Dao, Doan Thi Mai Huong, Vu Van Loi, Chau Van Minh, Pham Van Cuong. Microwave-assisted synthesis of lactams from amino acids. Vietnam Journal of Chemistry, 2015, 53 (2e), 198-201. 5. Phi Thi Dao, Vu Van Loi, Nguyen Thi Bich, Doan Thi Mai Huong, Nguyen Hien, Chau Van Minh, Pham Van Cuong. Synthesis of N-alkyl amino lactam derivatives. Journal of Science and Technology, 2016, 54 (2C), 291-298. 6. Phí Thị Đào, Đoàn Thị Mai Hương, Vũ Văn Lợi, Châu Văn Minh, Phạm Văn Cường. Nghiên cứu quy trình tổng hợp và hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất (2R,3R,4S,5R,6E)-3,4,5-trihydroxy-2- methoxy-8,8-dimetyl-n-((s)-2-oxoazepan-3-yl)non-6-enamide. Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (6e2),62-65. 7. Phí Thị Đào, Đoàn Thị Mai Hương, Vũ Văn Lợi, Nguyê n Thị Huệ, Phạm Văn Cường. In vitro cytotoxic and antimicrobial activities of some bengamide derivatives. Tạp chí Hóa học 2017 55(3), 342-347. 8. Giải pháp hữu ích. Phương pháp tổng hợp các dẫn xuất của bengamit. Đã được chấp nhận đơn hợp lệ
1 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Các hợp chất thiên nhiên được phân lập từ các loài thực vật trên đất liền đã được nghiên cứu từ rất lâu và đã thu được nhiều thành công. Tuy nhiên, nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên biển mới chỉ được bắt đầu từ khoảng giữa thế kỷ trước. Hiện nay, các hợp chất thiên nhiên biển đang được biết đến như một nguồn dược liệu đầy triển vọng và nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học cao với cấu trúc phức tạp đã được phát hiện từ các loài sinh vật biển khác nhau. Khó khăn trong việc thu mẫu lượng lớn và đòi hỏi kinh phí cao là một trong những trở ngại đối với các nghiên cứu trong lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên biển. Chính bởi vậy, tổng hợp hữu cơ là phương án lựa chọn hiệu quả trong việc tạo nguồn hoạt chất với lượng lớn hơn để phục vụ các nghiên cứu hoạt tính sinh học, cũng như việc đảm bảo khả năng ứng dụng của chúng. Nhiều hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên biển đóng vai trò như chất dẫn đường để từ đó các nhà khoa học tạo ra các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học cao hơn. Lớp chất bengamides được phân lập từ hải miên biển được biết đến có hoạt tính chống ung thư rất tiềm năng. Tuy nhiên, độ kém ổn định về mặt cấu trúc là một trong các nguyên nhân hạn chế khả năng ứng dụng của lớp chất này. Nhằm khắc phục hạn chế này của lớp chất bengamides, trong khuôn khổ luận án này, chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu: Tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học các analog của bengamide A và E. 2. Mục tiêu của luận án Xây dựng quy trình tổng hợp các analog của bengamide A và E, tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học của các analog tổng hợp được. 3. Ý nghĩa khoa học và những đóng góp mới của luận án 3.1. Ý nghĩa khoa học - Luận án đã đóng góp tổng hợp được các analog mới của bengamide A và E. - Ứng dụng phương pháp chiếu xạ vi sóng trong tổng hợp hữu cơ. 3.2. Những đóng góp mới của luận án
2 Đã tổng hợp được 30 analog của bengamide A và E trong đó có 16 analog của bengamide E, 4 analog bengamide A và 10 hợp chất có chứa flo Đã xây dựng được quy trình tổng hợp lập thể của các analog của bengamide A và E. Đã sử dụng phương pháp chiếu xạ vi sóng trong phản ứng đóng vòng nội phân tử acid amine, phản ứng bảo vệ nhóm chức amine bậc 1 và phản ứng kết nối chuỗi ketide và aminolactam giúp rút ngắn thời gian phản ứng, nâng cao hiệu suất phản ứng. Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các analog tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Lu, NCI-H1975, A549, MCF7, MDA-MB-231, HepG2, Hep3B, KB, HL60 và Hela) trong đó nhiều analog thể hiện hoạt tính mạnh với IC 50 < 1µM. Đã khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của một số analog trên 7 chủng gram (+), gram (-) và nấm men. Kết quả cho thấy một số analog cũng có hoạt tính với chủng gram (+). 4. Bố cục của luận án Luận án dày 153 trang với 25 bảng số liệu, 65 hình và 57 tài liệu tham khảo được bố cục như sau: Mở đầu: 2 trang Chương 1: Tổng quan 32 trang Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu 64 trang Chương 3: Kết quả và thảo luận 41 trang Kết luận, kiến nghị: 2 trang Ngoài ra, luận án còn có phần phụ lục gồm các phổ của các analog bengamide tổng hợp được. II. NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐẶT VẤN ĐỀ Đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan gồm 32 trang, tổng kết tài liệu về các bengamide phân lập
3 từ tự nhiên. Các phương pháp tổng hợp các analog của bengamide và hoạt tính sinh học của chúng. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM Phương pháp nghiên cứu gồm 4 trang mô tả các phương pháp tổng hợp hữu cơ, các phương pháp xác định cấu trúc hóa học và các phương pháp thử hoạt tính sinh học. Thực nghiệm gồm 64 trang mô tả chi tiết quy trình tổng hợp các analog bengamide. Các tính chất vật lý và số liệu phổ của các chất tổng hợp được. Chúng tôi đã đưa ra phương pháp tổng hợp các dãy chất sau: - Tổng hợp chuỗi ketide - Tổng hợp các dẫn suất thế N-ankyl aminolactam vòng 6 và vòng 7. - Tổng hợp các analog của bengamide A và E - Tổng hợp các analog bengamide chứa flo. Đã thử hoạt tính gấy độc tế bào của 30 analog tổng hợp được trên 10 dòng tế bào (Lu1, NCI-H1975, A549, MCF7, MDA-MB-231, HepG2, Hep3B, KB, HL60 và Hela). Đã thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên 7 chủng gram (+), gram âm (-) và nấm men. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các nghiên cứu đã công bố về tổng hợp và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư đối với các analog của bengamide cho thấy sự biến đổi cấu trúc của khung bengamide ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính sinh học. Đặc biệt, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự có mặt của các nhóm hydroxyl và cấu hình của C-3, C-4 và C-5 của chuỗi ketide đóng vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt tính gây độc tế bào của lớp chất này. Nhằm nghiên cứu mối tương quan giữa cấu trúc hoạt tính gây độc tế bào của các analog bengamide, trong khuôn khổ luận án này, việc biến đổi cấu trúc khung bengamide được thực hiện theo các hướng sau: i) thay thế nhóm isopropyl bằng nhóm nhóm tert-butyl tạo các chất có cấu trúc ổn định hơn do tránh được sự dịch chuyển nối đôi từ C-7/C-8 sang vị trí C-8/C-9 (isomer hóa); ii) thay đổi cấu hình của cacbon C-2 của vòng
4 lactam tạo các cặp đồng phân diastereomer, qua đó có thể đánh giá ảnh hưởng của cấu hình C-2 đến hoạt tính; iii) N-alkyl hóa nhóm amide của vòng lactam, iv) tổng hợp một số analog với nhóm hydroxyl tại C-5 ; v) thay đổi kích cỡ vòng lactam; vi) thay thế phần olefin cuối mạch bằng nhóm FCH 2-CH(OH)- nhằm đánh giá vai trò của phần cấu trúc olefin cuối mạch (Hình 3.1). Hình 3.1. Định hướng các biến đổi trên khung bengamide Quy trình tổng hợp các analog mới của bengamide được thực hiện từ chất thương mại α-d-glucoheptonic γ-lactone và các acid amine (Lornithine monohydrochloride, D-ornithine monohydrochloride, L-lysine, D-lysine và D,L-5-hydroxylysine hydrochloride) qua 3 giai đoạn chính. 3.1. Tổng hợp chuỗi ketide Quá trình tổng hợp ketide BG5 được thực hiện với việc sử dụng hợp chất đầu đã được thương mại hóa, α-d-glucoheptonic γ-lactone (Hình 3.2). Phản ứng acetonide hóa tạo ra BG1 sử dụng tác nhân acetone với xúc tác acid sulphuric cho hiệu suất là 67,8 %. Hình 3.2. Sơ đồ phản ứng tổng hợp ketide BG5 Thủy phân chọn lọc một nhóm isopropylidene của BG2 bằng
5 acid acetic thu được hợp chất BG3 với hiệu suất phản ứng đạt 85%. Nghiên cứu phản ứng oxy hóa cắt mạch diol với tác nhân NaIO 4 trong hỗn hợp các loại dung môi khác nhau cho thấy với việc sử dụng 1,2 eq NaIO 4 trong hỗn hợp dung môi MeCN và H 2O tỷ lệ 4/1 (v/v) thu được sản phẩm aldehyde BG4 với hiệu suất phản ứng cao nhất (91%). Phản ứng cuối cùng là quá trình olefin hóa aldehyde BG4. Phản ứng được nghiên cứu việc sử dụng tác nhân (P(t-Bu) 3HBF 4) (1,5-3 eq) với sự có mặt của TEA, potassium t-butoxide ((CH 3) 3COK) hoặc với NaH (1,5 eq) trong dung môi THF ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 3 24 h. Tuy nhiên các phản ứng trên đều không tạo thành sản phẩm BG5. Phản ứng sau đó được thực hiện thành công theo phương pháp của Takai (Takai reaction) với việc sử dụng tác nhân 1,1-diiodo-2,2 dimethylpropane và CrCl 2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, phản ứng sử dụng tác nhân 1,1-diiodo-2,2 dimethylpropane từ hãng Aldrich, hợp chất ketide BG5 tạo thành với hiệu suất cao nhất đạt 45%. Trong khi đó, hợp chất ketide BG5 thu được với hiệu suất cao hơn nhiều (73%), khi phản ứng được thực hiện với tác nhân 1,1-diiodo-2,2 dimethylpropane tự tổng hợp. Cơ chế của phản ứng oxi hóa cắt mạch BG3 và sự hình thành BG5 từ BG4 với việc sử dụng phản ứng Takai được trình bày trong hình dưới đây. Hình 3.3: Cơ chế phản ứng tổng hợp BG5
6 Theo đó, trong phản ứng oxi hóa với NaIO 4 thì mức oxi hóa của iodine chuyển từ +7 (NaIO 4) xuống +5 (NaIO 3). Đối với phản ứng tổng hợp olefin theo Takai, đây là sự kết hợp giữa các aldehyde và dihaloalkan geminal để tạo thành olefin. Trong phản ứng này Cr (II) đã bị oxy hóa thành Cr (III) khi thay thế cả hai nguyên tử halogen. Các geminal carbodianion hình thành phản ứng với aldehyde tạo thành anken. Công thức cấu tạo của các chất được xác định dựa vào số liệu phổ MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR.và so sánh với tài liệu đã được công bố. 3.2. Phản ứng tổng hợp các hợp chất 2-amino lactam 3.2.1. Phản ứng tổng hợp các chất BG6a-b và BG14a-b Cấu trúc vòng α-amino lactam tồn tại trong nhiều hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học cao. Do đó việc tổng hợp α-amino lactam đã thu hút sự chú ý của nhiều nhóm nghiên cứu. Điển hình là việc tổng hợp α- aminocaprolactam từ L-lysine. Theo công trình công bố của G.Pifferi và cộng sự, phản ứng đóng vòng tạo BG14a từ L-lysine trong điều kiện đun khuấy thông thường cho hiệu suất đạt 95% với thời gian thực hiện phản ứng là 48 h. Trong một nghiên cứu khác, Blade-Front công bố quy trình tổng hợp BG14a đạt hiệu suất 70% trong thời gian ngắn hơn (20 h) với việc sử dụng tác nhân Al 2O 3 trong hỗn hợp toluene/pyridine. Ngoài ra, phản ứng tổng hợp BG14a từ L-lysine còn được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ và áp suất cao với hiệu suất sản phẩm đạt 88%. Để khắc phục những nhược điểm sử dụng tác nhân đắt tiền, độc hại, thời gian thực hiện phản ứng dài hoặc thực hiện phản ứng trong điều kiện nhiệt độ và áp suất cao, chúng tôi đã nghiên cứu phản ứng đóng vòng nội phân tử các acid amine với sự trợ giúp của vi sóng. Theo đó, hợp chất α-aminocaprolactam (BG14a) đạt hiệu suất 79% từ L-lysine với điều kiện phản ứng được thực hiện trong ethylene glycone dưới chiếu xạ của vi sóng ở 284 W trong vòng 1 h. Trong khi đó, hiệu suất BG14a tạo thành thấp hơn (48%) nếu thực hiện phản ứng trong dung môi butanol. Áp dụng điều kiện phản ứng tương tự, hợp chất BG14b được tổng hợp với hiệu suất 82% từ D-lysine. Đối với việc tổng hợp các hợp chất amino lactam vòng 6 cạnh BG6a và BG6b, dưới sự chiếu xạ của vi sóng ở 284
7 W trong khoảng thời gian 60 phút trong ethylene glycol với sự có mặt của pyridine đạt hiệu suất 55,6%. Khi thay thế pyridine bằng dung dịch NaHCO 3 10% và thực hiện phản ứng tương tự với sự trợ giúp của vi sóng, hợp chất amino lactam BG6a thu được đạt hiệu suất 78%. Áp dụng quy trình tương tự, hợp chất amino lactam BG6b được tổng hợp với hiệu suất 72% từ D-ornithine hydrochloride. 3.2.2. Phản ứng tổng hợp các chất rac-bg22a và rac- BG22b (i): dd NaHCO 3 10%, ethylen glycon, pyridine, MW, 284W, 1h (ii): (Boc) 2O (1eq), TEA, THF, H 2O, rt, 3h Do các đồng phân quang học của 5-hydroxylysine không còn được thương mại hóa, nên các đồng phân 6-hydroxycaprolactam được điều chế từ hỗn hợp racemic của 2 đồng phân diastereomer của hợp chất 5- hydroxylysine. Theo đó, phản ứng đóng vòng nội phân tử của hỗn hợp D,L-5-hydroxylysine hydrochloride được thực hiện với sự chiếu xạ vi sóng ở công suất 284 W trong thời gian 60 phút tạo thành hỗn hợp racemic của 2 đồng phân diastereomer rac-bg22a và rac-bg22b. Hỗn hợp sản phẩm được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi acetone/h 2O/NH 4OH tỷ lệ 9/1/0,1 thu được các hợp chất racemic rac- BG22a (53%, R f = 0,49) và rac-bg22b (39%, R f = 0,34). Do không thể xác định trực tiếp cấu hình tương đối tại C-3 và C-6 của rac-bg22a và rac-bg22b, nên các hợp chất này được chuyển hóa thành dẫn xuất N- Boc nhằm so sánh với dữ liệu phổ NMR đã được công bố. Phản ứng của từng hợp chất rac-bg22a và rac-bg22b với tác nhân Boc 2O được thực hiện trong hỗn hợp dung môi THF/H 2O với sự có mặt của TEA tạo ra các
8 hợp chất rac-bg23a và rac-bg23b tương ứng. So sánh với dữ liệu phổ NMR đã công bố cho thấy rac-bg23a có cấu hình 3,6-trans (3S*,6S*). Như vậy cấu hình 3,6-cis (3S*,6R*) được xác định cho hợp chất rac- BG23b. Từ đó cho phép xác định cấu hình 3,6-trans (3S*,6S*) và 3,6-cis (3S*,6R*) tương ứng cho các hợp chất rac-bg22a và rac-bg22b. 3.2.3. Phản ứng tổng hợp các N-ankylaminolactam 3.2.3.1. Phản ứng bảo vệ nhóm chức amine của các 2-aminolactam Để bảo vệ nhóm chức amine bậc 1, các hợp chất 3-aminolactam được cho phản ứng với anhydride phthalic. Phản ứng giữa BG6a và anhydride phthalic được thực hiện trong acid acetic ở nhiệt độ 100 o C trong 6 giờ thu được hợp chất BG7a với hiệu suất thấp (30%). Sau đó thực hiện phản ứng với sự trợ giúp của vi sóng hợp chất BG7a thu được với hiệu suất cao hơn (53%) và thời gian ngắn hơn (1 giờ). Sử dụng điều kiện phản ứng tương tự dưới sự chiếu xạ vi sóng, nhóm amine của các hợp chất BG6b, BG14a và BG14b cũng được bảo vệ, thu được các hợp chất BG7b, BG15a và BG15b với hiệu suất trong khoảng 52 57%. a) anhydride phthalic, CH 3COOH, rây phân tử 4Ǻ, MW, 284 W, 1 h 3.2.3.2. Phản ứng N-alkyl hóa các hợp chất. Sau khi bảo vệ nhóm amine bậc 1, phản ứng alkyl hóa được thực hiện lần lượt với các tác nhân alkylhalogen, (bromomethyl)cyclohexane, benzyl bromide và cinnamyl bromide. Hợp chất BG7a được lựa chọn cho việc nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng. Phản ứng giữa BG7a và (bromomethyl)cyclohexane, benzyl bromide hoặc cinnamyl bromide không tạo ra sản phẩm N-alkyl mong muốn khi sử dụng các tác nhân kiềm
9 như K 2CO 3, KOH hay NaH trong các dung môi DMF hoặc THF. Tuy nhiên, khi phản ứng được thực hiện trong dung môi DMSO, sự hình thành các sàn phẩm N-alkyl mong muốn BG8a-BG10a đã được ghi nhận. Kết quả cho thấy việc sử dụng dung môi DMSO và tỷ lệ tác nhân KOH (2 eq), K 2CO 3 (2 eq) và KI (1 eq) ở nhiệt độ 50 60 o C cho hiệu suất phản ứng cao nhất. Sử dụng điều kiện phản ứng tương tự, các hợp chất N-alkyl khác đã đuợc tổng hợp với hiệu suất 45-55%. (a) (bromomethyl)cyclohexane hoặc (bromomethyl)benzene hoặc cinnamyl bromide, DMSO, KOH, K 2CO 3, KI, 23h; (b) hydrazine, MeCN, 1h. Cuối cùng, nhóm bảo vệ được loại bỏ thông qua việc xử lý các hợp chất BG8a BG10a, BG8b BG10b, BG16a BG18a, BG16b BG18b với dung dịch hydrazine trong dung môi acetonitrile ở nhiệt độ phòng thu được các N-ankylaminolactam tương ứng, BG11a-13a, BG11b-13b, BG19a-21a và BG19b-21b. 3.3. Tổng hợp các analog của bengamide E Quá trình tổng hợp các bengamide được tiến hành thông qua phản ứng kết hợp giữa phần ketide và các aminolactam. Thực tế, quá trình phản ứng mở vòng lactone của ketide BG5 đã được nghiên cứu và công bố trước đây. Theo đó, David D. Xu và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng của BG5 và amine LAF-A. Các tác giả nhận thấy, trong điều kiện sử dụng tác nhân sodium 2- ethyl hexanoate trong dung môi THF ở nhiệt độ phòng, sản phẩm LAF-B tạo thành với hiệu suất từ 85 92% sau 20 giờ.
10 Hình 3.9. Phản ứng kết hợp của BG5 và LAF-A do David công bố Phương pháp của David D. Xu và cộng sự có ưu điểm là sử dụng tác nhân rẻ tiền, điều kiện êm dịu, tuy nhiên thời gian phản ứng kéo dài (15-20 giờ). Trong khuôn khổ luận án này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sự trợ giúp của vi sóng nhằm rút ngắn thời gian phản ứng. Phản ứng giữa BG5 và BG6a được sử dụng để nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng. Theo đó, với việc sử dụng sodium 2- ethyl hexanoate trong dung môi THF hoặc 1,4-dioxane, ở nhiệt độ từ 50 100 o C, trong 10 đến 24 giờ, hiệu suất sản phẩm BG24a thu được từ 50 58%. Trong khi đó, dưới sự chiếu xạ của vi sóng, thời gian phản ứng được rút ngắn đáng kể và hiệu suất sản phẩm BG24a thu được đạt 87%. Như vậy có thể thấy, phản ứng giữa BG5 và BG6a đạt được hiệu suất cao nhất khi sử dụng 1,2 1,5 eq sodium 2- ethyl hexanoate, dưới chiếu xạ vi sóng tại 100 W trong 1 giờ. Bảng 3.7. Điều kiện phản ứng tổng hợp BG24a Dung môi sodium 2- ethyl hexanoate MW Nhiệt độ Thời gian Hiệu suất 1,4- dioxane 2 eq - 100 o C 10h 50% 1,4- dioxane 1,5 eq - 100 o C 10h 50% THF 1,5 eq - 50-60 o C 24h 58% THF 1,5 eq 284 W >100 o C 30 phút 55%
Dung môi sodium 2- ethyl hexanoate 11 MW Nhiệt độ Thời gian Hiệu suất THF 1,5 eq 100 W 50-60 o C 1h 87% THF 1,2 eq 100 W 50-60 o C 1h 87% THF 1 eq 100 W 50-60 o C 1h 80% Sử dụng điều kiện phản ứng tương tự như quá trình tổng hợp BG24a, các sản phẩm BG24b, BG25a BG31a và BG25b BG31b cũng được tổng hợp. Hiệu suất phản ứng của các hợp chất này thu được trong khoảng 64 95%. Cấu trúc của các sản phẩm BG24a - BG31a, BG24b - BG31b, đã được khẳng định bằng phân tích dữ liệu phổ MS và NMR. Chẳng hạn đối với hợp chất BG24a, pic ion giả phân tử ở m/z 421 [M+Na] + được quan sát thấy trên phổ ESI-MS. Mặt khác, phổ 13 C-NMR và DEPT của BG24a cho tín hiệu của 20 nguyên tử cacbon trong đó có 2 nhóm cacbonyl ở C 171,1 (C-1 ), 170,5 (C-1), 1 nhóm methoxy ở C 59,8 (C- 12), 2 nhóm metin sp 2, 3 nhóm methylene, 5 nhóm metin sp 3, 5 nhóm methyl và 2 cacbon bậc 4.
12 Hình 3.12. Phổ 13 C-NMR giãn rộng của hợp chất BG24a Trên phổ 1 H-NMR của BG24a xuất hiện tín hiệu của 5 nhóm methyl ở H 1,03 (9H, s, Me-9,10,11), 1,47 (3H, s, Me-15), 1,49 (3H, s, Me-16), 2 proton olefin ở H 5,77 (1H, dd, J = 0,5; 16,0 Hz, H-7), 5,55 (1H, dd, J = 7,0; 16,0 Hz, H-6) và 1 nhóm methoxy ở H 3,46 (3H, s). Hơn nữa, tín hiệu của 1 nhóm NH được ghi nhận ở H 7,32 (1H, d, J = 5,5 Hz, NH-13), 1 nhóm metin ở H 4,33 (1H, m, H-2 ), 1 nhóm methylen liên kết với nitơ ở H 3,36 (3H, m, CH 2-5 và OH) và 4 nhóm oxymetin nằm trong khoảng H 3,91-4,25 cũng được quan sát thấy trên phổ 1 H-NMR. Ngoài ra, trên phổ 1 H-NMR cũng cho tín hiệu của 4 proton nằm trong khoảng H 1,57-2,57 được xác định thuộc về 2 nhóm methylene nhờ phân tích phổ HSQC. Hình 3.13. Phổ 1 H-NMR giãn rộng của hợp chất BG24a
13 Như vậy có thể thấy, các tín hiệu thu được từ phổ 1D-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hóa học của BG24a. Hơn nữa, sự gắn kết của phần ketide với aminolactam thông qua liên kết C-1/N-13 được khẳng định từ tương tác của H-2 ở H 4,33 với nhóm cacbonyl C-1 tại C 171,1 trên phổ HMBC. Hình 3.14. Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của chất BG24a Giai đoạn cuối cùng trong quy trình tổng hợp các analog bengamide là loại bỏ nhóm bảo vệ acetonide. Quá trình phân tách nhóm acetonide được thực hiện trong môi trường acid TFA ở nhiệt độ 0 o C trong thời gian 1,5 h cho hiệu suất phản ứng đạt 35-69%. Bảng 3.9. Phản ứng loại bỏ nhóm acetonide Cấu trúc của các analogue của bengamide 32a-b 39a-b đã được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Phổ khối lượng thu được trên phổ HRESI-MS của các hợp chất này hoàn toàn phù hợp với công
14 thức phân tử dự kiến. Ngoài ra, trên phổ 1D NMR của các các analogue 32a-b 39a-b, không còn các tín hiệu của nhóm acetal so với các hợp chất acetonide tương ứng. Đồng thời cấu trúc hóa học của các analogue 32a-b 39a-b còn được chứng minh bằng phổ NMR 2 chiều. Hinh 3.18. Phổ 13 C-NMR của chât BG32a Hinh 3.19. Phổ 1 H-NMR của chât BG32a Hinh 3.19. Phổ 1 H-NMR của chât BG32a
15 3.4. Tổng hợp các analog của bengamide A (a):mw,100w, 120 mn, 1,4-dioxan, sodiun-2 ethylhexanoate Áp dụng quy trình phản ứng mở vòng lactone của ketide BG5 với các aminolactam dưới điều kiện chiếu xạ vi sóng như được trình bày ở phần trên, các acetonide BG40a-d cũng đã được tổng hợp. Hợp chất BG5 khi được cho phản ứng với hỗn hợp racemic rac-bg22a (3S*,6S*) tạo thành 2 đồng phần diastereomer BG40a và BG40b. Hai đồng phần diastereomer BG40a và BG40b được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng điều chế. Cấu trúc hóa học của các hợp chất BG40a-d được khẳng định thông qua các phân tích phổ, đặc biệt phổ NMR. Sự hình thành liên kết amide giữa chuỗi ketide và phần aminolactam được chứng minh bởi tương tác của cacbonyl C-1 với proton H-2, và tương tác của proton amide (NH-13) với C-1 và C-1 trên phổ HMBC. So sánh dữ liệu phổ NMR và độ quay cực với hợp chất bengamide Y [13], cho phép xác định cấu hình 2 S,5 S cho hợp chất BG40a. Như vậy cấu hình 2 R,5 R được gán cho hợp chất BG40b.
16 Tương tự, phản ứng giữa BG5 với hợp chất hỗn hợp racemic rac-bg22b (3S*,6S*) thu được 2 đồng phần diastereomer BG40c và BG40d, sau khi được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng điều chế. Cấu hình 2 S,5 R được xác định cho BG40c và cấu hình 2 R,5 S cho BG40d dựa vào so sánh dữ liệu phổ NMR và độ quay cực với công bố trước đây. Hình 3.39. Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của BG40a Tương tự các analog bengamide E, các analog của bengamide A được tổng hợp thông qua phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ acetonide của các hợp chất BG40a-d trong dung môi THF với sự có mặt của TFA ở nhiệt độ 0 5 o C trong thời gian 2 h. So sánh dữ liệu phổ NMR của các sản phẩm BG41a-d với các hợp chất acetonide BG40a-d cho thấy mất đi tín hiệu của 2 nhóm methyl và 1 cacbon bậc 4 điều này chứng tỏ nhóm acetonide đã được loại bỏ.
17 3.5. Phản ứng tổng hợp các analog bengamide chứa flo Để hiểu rõ vai trò của phần olefinic cuối mạch đối với hoạt tính của lớp chất bengamide, trong hướng nghiên cứu tiếp theo chúng tôi đã tiến hành tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của các analogue trong đó phần olefinic cuối mạch được thay thế bằng nhóm CH(OH)-CH 2F. Quy trình tổng hợp các analoge này được thực hiện như miêu tả trong hình 3.45. Hình 3.45: Sơ đồ tổng hợp các analog bengamide chứa flo. Quá trình điều chế các analoge có chứa flo được thực hiện trước tiên bằng phản ứng flo hóa hợp chất BG3 với tác nhân diethylaminosulfur trifluoride (DAST) ở nhiệt độ phòng cho phép thu được dẫn xuất flo BG3F với hiệu xuất 42%. Trong điều kiện phản ứng này, quá trình flo hóa xảy ra chọn lọc tại nhóm hydroxyl bậc 1. Cấu trúc của sản phẩm tạo thành BG3F được khẳng định qua phân tích các dữ liệu phổ. Phổ khối lượng phân giải cao (HRESI-MS) cho pic ion giả phân tử [M-H] - tại m/z 263,0928 phù hợp với công thức dự kiến C 11H 16FO 6 của BG3F. Ngoài ra, sự hiện diện của flo trong cấu trúc của BG3F, còn được thể hiện qua các tín hiệu kép được gây ra bởi
18 tương tác với nguyên tử flo của C-7 [δ C 83,7 (d, J C-F = 166,25 Hz)], C-6 [δ C 68,6 (d, 2 J C-F = 18,75 Hz)] và C-5 [67,0 (d, 3 J C-F = 6,25 Hz)]. Dẫn xuất flo BG3F sau đó được cho phản ứng với các aminolactams đã điều chế ở trên, trong sự có mặt của sodium 2- ethylhexanoate dưới điều kiện chiếu xạ vi sóng ở 100 W, trong thời gian 1 giờ thu được các hợp chất mở vòng lactone tương ứng. Cấu trúc hóa học của các sản phẩm mở vòng cũng đã được khẳng định bằng các phương pháp phổ, đặc biệt phổ HMBC. Trong đó, sự gắn kết của vòng aminolactam và chuỗi polyketide được minh chứng qua tương tác của C- 1, C-2 và C2 với proton NH của nhóm amide hình thành. Hình 3.50. Một số tương tác chính trên phổ HMBC, COSY của chất BG4Fa và BG4Fb Tương tự như đối với quá trình loại bỏ nhóm acetonide trong tổng hợp các analogue bengamide A được trình bày ở phần trên, phản ứng loại nhóm bảo vệ acetonide của hợp chất BG4Fa được thực hiện với tác nhân acid TFA, dung môi THF ở điều kiện nhiệt độ 0 o C đến nhiệt độ
19 phòng. Tuy nhiên, trong điều kiện phản ứng này, hợp chất đầu bị phân hủy và không thu được sản phẩm mong muốn. Các nghiên cứu của chúng tôi sau đó cho thấy rằng sử dụng tác nhân acid HCl 1N đối với việc loại bảo acetonide của hợp chất BG4Fa cho phép thu được sản phẩm momg muốn. Theo đó, sản phẩm BG4Fa thu được với hiệu suất 33 50% dưới điều kiện sử dụng HCl 1N trong dung môi THF với thời gian 24 giờ. Trong khi đó, khi sử dụng dung môi MeOH thay cho THF, sản phẩm BG4Fa thu được với hiệu suất cao hơn (58 66%) và thời gian ngắn hơn (5 giờ). Có thể thấy, việc sử dụng dung dịch HCl 1N trong dung môi MeOH là phù hợp hơn đối với phản ứng loại bỏ nhóm acetonide của dãy analogue bengamide có chứa flo. 3.6. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được 3.6.1. Hoạt tính gây độc tế bào Các analog bengamide đã tổng hợp, được thử hoạt tính đối với 6 dòng tế bào ung thư (KB, HepG-2, LU-1, MCF-7, HL-60 và Hela). Kết quả cho thấy các analog có cấu hình C-2 R phi tự nhiên thể hiện hoạt tính tốt hơn các epimer C-2 S là các dẫn xuất có cấu hình giống các hợp chất phân lập được từ tự nhiên (Bảng 3.13 ). Các analog có vòng aminolactam là vòng 7 hầu như thể hiện hiện hoạt tính tốt hơn các analog vòng 6 cùng loại. Đối với 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, các hợp chất thể hiện hoạt tính mạnh hơn trên 4 dòng tế bào ung thư biểu mô KB, ung thư phổi
20 LU-1, ung thư gan HepG-2 và ung thư vú MCF-7 so với 2 dòng tế bào ung thư còn lại là tế bào ung thư máu HL-60 và ung thư cổ tử cung Hela. Chín hợp chất, BG34b, BG35a, BG35b, BG36b, BG37b, BG38a, BG38b, BG39a và BG39b thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với cả 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Đặc biệt, hợp chất BG36b thể hiện khả năng ức chế mạnh đối với 6 dòng tế bào ung thư KB, HepG-2, LU-1, MCF-7, HL-60 và Hela với giá trị IC 50 lần lượt là 1,1; 1,1; 0,5; 0,2; 5,4 và 2,3 µm. Mặt khác, hợp chất BG36a và BG36b thể hiện hoạt tính ức chế chọn lọc đối với dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với giá trị IC 50 lần lượt là 1,3 và 0,2 µm, trong khi hợp chất BG37b và BG38b ức chế chọn lọc đối với 3 dòng tế bào ung thư KB, HepG-2 và LU-1 với giá trị IC 50 nằm trong khoảng 0,3-1,1 µm. Ngoài ra, hợp chất BG39a và BG39b thể hiện hoạt tính chọn lọc đối với 2 dòng tế bào ung thư KB và HepG-2 với với giá trị IC 50 nằm trong khoảng 0,4-1,9 µm. Bảng 3.13. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của analog bengamide tổng hợp Analog IC50 (µm) KB HepG-2 Lu-1 MCF-7 HL-60 Hela BG32a 22,1 >50 13,8 >50 >50 >50 BG32b 11,1 22,0 2,6 >50 >50 >50 BG33a 8,2 11,8 12,7 20,1 >50 >50 BG33b 2,4 6,6 2,6 8,8 >50 >50 BG34a 2,9 11,3 7,5 17,8 >50 39,7 BG34b 4,4 12,0 2,7 20,4 29,0 19,7 BG35a 2,3 6,6 5,8 4,3 36,8 36,8 BG35b 1,7 2,4 2,3 15,1 21,5 16,1
21 Analog IC50 (µm) KB HepG-2 Lu-1 MCF-7 HL-60 Hela BG36a 21,0 21,1 4,3 1,3 >50 >50 BG36b 1,1 1,1 0,5 0,2 5,3 2,1 BG37a 11,8 >50 17,1 >50 >50 >50 BG37b 0,4 1,0 0,3 10,4 19,5 39,1 BG38a 5,7 4,8 7,7 32,5 45,6 41,5 BG38b 1,0 1,9 1,1 8,6 10,6 16,2 BG39a 1,9 1,5 23,6 4,9 13,4 26,9 BG39b 1,1 0,4 25,1 2,7 8,9 9,5 BG41a 19,8 >50 10,0 >50 >50 >50 BG41b 5,1 21,3 17,2 >50 12,1 15,4 BG41c >50 >50 23,4 23,4 >50 >50 BG41d 23,7 >50 36,3 >50 >50 >50 BGF5a >50 >50 >50 >50 >50 >50 BGF5a >50 >50 >50 >50 >50 >50 Elipticine 1,2 1,6 1,2 2,4 2,0 1,6 Chất đối chứng dương: Elipticine Các hợp chất có nhóm OH ở vị trí 5 thể hiện hoạt tính thấp hơn các analog không chứa chóm OH trên vòng lactam. Trong số các hợp chất này, hai hợp chất BG41a và BG41b thể hiện hoạt tính đáng kể tương ứng đối với tế bào ung thư Lu-1 và KB. Hai hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính đáng kể trên cả 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Mặt khác, hai hợp chất chứa flo BG5Fa-b không thể hiện hoạt tính đối với 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Hơn nữa, các hợp chất
22 chứa flo còn lại (BG7Fa-b, BG9Fa-b, BG11Fa-b, BG13Fa-b) cũng đã được thử nghiệm đối với sáu dòng tế bào ung thư khác là ung thư phổi NCI-H1299, A549, ung thư vú MCF-7, MDA-MB-231, ung thư gan Hep3B và ung thư cổ tử cung Hela. Tuy nhiên, tất cả các hợp chất này đều không thể hiện hoạt tính. Điều này cho thấy phần cấu trúc olefin cuối mạch ketide trong lớp chất bengamide dường như đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính gây độc tế bào. Ngoài ra, để hiểu rõ hơn sự ảnh hưởng của tính linh hoạt của chuỗi ketide và của các nhóm hydroxy tự do tại C-3, C-4 và C-5 đến hoạt tính gây độc tế bào, một số hợp chất acetonid BG24a-b, BG28a-b và BG31a-b cũng đã được thử hoạt tính đối với sáu dòng tế bào ung thư KB, HepG-2, LU-1, MCF-7, HL-60 và Hela.. Tuy nhiên, hầu hết các hợp chất này đều không thể hiện hoạt tính hoặc kém hơn nhiều so với các analog tương ứng đã được bỏ bảo vệ acetonid. Điều này có thể được giả thiết là do sự có mặt của nhóm acetonide nên hạn chế sự quay tự do của liên kết C-3/C-4/C-5, qua đó làm hạn chế tính linh hoạt của chuỗi polyketide, đồng thời hai nhóm hydroxyl tại C-3 và C-5 không còn ở trạng thái tự do. Điều này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu đã công bố trước đây của nhóm tác giả Xu W. và cộng sự về vai trò của các nhóm hydroxyl tại C-3, C-4 và C-5. Theo đó, một trong các yếu tố quan trọng góp phần tạo ra hoạt tính của lớp chất bengamide đó là khả năng liên kết tạo phức của bengamide với enzyme Methionine aminopeptidase thông các liên kết tạo phức của 3 nhóm hydroxyl tại C-3, C-4 và C-5 của chuỗi polyketide với các ion kim loại của phân tử protein Methionine aminopeptidase. 3.6.2.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Một số analog bengamide được lựa chọn thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với 3 chủng Gram (+) (Enterococcus faecalis,
23 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus), 3 chủng Gram (-) (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica) và 1 chủng nấm (Candida albicans). Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của một số analog Analog Gram (+) MIC (µg/ml) Gram (-) MIC (µg/ml) Nấm men E.faecalis S.aureus B.cereus E.Coli P.aeruginosa S. enterica C.albicans BG32a 64 128 32 - - - 128 BG34b 128 256 32 - - - 256 BG35b 32 64 4 - - - 64 BG37a 64-32 - - - 128 BG37b - - - - - - - BG38a 128-64 - - - 256 BG38b 64 32 4 - - - 128 BG39a - - - - - - - BG39b 32 16 4 - - - 64 S 256 256 128 32 256 128 - T 4 16 64 8 256 256 - K 128 4 8 128 64 16 - C - - - - - - 32 Chất đối chứng dương: S: Steptomycin; T: Tetramycin; K: Kanamycin; C: Cyclohexamide; (-): không có hoạt tính KẾT LUẬN Với việc sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ khác nhau, 30 analog của bengamide đã được tổng hợp. Trong đó có 16 analog của bengamide E, 4 analog bengamide A và 10 hợp chất có chứa flo. Trong quá trình tổng hợp các hợp chất này, các bước phản ứng đã được nghiên cứu tối ưu hóa so với các phương pháp đã công bố trước đây. Cụ thể, ứng dụng chiếu xạ vi sóng lần đầu tiên được thực hiện giúp rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu suất phản ứng trong các phản ứng sau: + Phản ứng tổng hợp các aminolactam từ các acid amine tương ứng. + Phản ứng bảo vệ nhóm amine bậc 1 với anhdric phthalic
24 + Phản ứng kết hợp aminolactam với chuỗi polyketide thông qua quá trình mở vòng lactone Các hợp chất tổng hợp được đã được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 10 dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy 20 hợp chất thể hiện hoạt tính đối với 1 số dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Trong đó một số hợp chất có hoạt tính mạnh với IC 50 < 1µM. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên 6 chủng vi khuẩn và 1 chủng nấm cho thấy một số hợp chất có hoạt tính tốt đối với chủng Gram (+). Ngoài ra, các hợp chất BG35b và BG39b còn thể hiện hoạt tính tốt với chủng nấm. Đây là nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất thuộc lớp chất bengamide. Đánh giá mối tương quan cấu trúc hoạt tính cho thấy, các hợp chất có cấu hình C-2 R thể hiện hoạt tính tốt hơn cấu hình C-2 S. Cho đến nay các hợp chất bengamide được phân lập từ tự nhiên đều có cấu hình C-2 S. Đây là lần đầu tiên các analog bengamide với cấu hình C-2 R được tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học. Việc phát hiện các đồng phân diastereomer với cấu hình C-2 R có hoạt tính cao hơn các đồng phân diastereomer với cấu hình C-2 S tương ứng là điều rất thú vị, tạo cơ sở cho các định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn thuộc lớp chất này. Quá trình thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, các analog chứa flo không thể hiện hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Đồng thời các hợp chất chứa nhóm bảo vệ acetonide với cấu trúc cứng tại C-3/C-4/C-5 có hoạt tính kém hơn nhiều so với các hợp chất tương ứng có chứa 3 nhóm hydroxyl tự do tại C-3, C-4 và C-5. Điều này cho thấy phần cấu trúc olefin cuối mạch và nhóm tert-butyl, sự có mặt của 3 nhóm hydroxyl tự do tại C-3, C-4 và C-5 và tính linh động của các liên kết C-3/C-4/C-5 đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính gây độc tế bào của lớp chất bengamide.