THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC THỬ NGHIỆM CẢM NHIỄM BÀO TỬ Perkinsus olseni VÀO NGHÊU BẾN TRE (Meretrix lyrata) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM INFECTION OF PARASITES Perkinsus olseni INTO BEN TRE HARD CLAM (Meretrix lyrata) BY SOAKING METHOD TÓM TẮT Phạm Quốc Hùng 1, Nguyễn Thị Hồng Nhung 1 Ngày nhận bài: 10/3/2017; Ngày phản biện thông qua: 30/6/2017; Ngày duyệt đăng: 25/9/2017 Nghiên cứu được tiến hành với mục đích cảm nhiễm bào tử ký sinh trùng Perkinsus olseni vào nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) bằng phương pháp ngâm. Thí nghiệm có ba nghiệm thức gồm ngâm nghêu trong 3 lít nước biển 25 có bào tử động (2x10 5 bào tử/ml), bào tử nghỉ (13 bào tử/ml) của P. olseni và nghiệm thức đối chứng không chứa bào tử. Sau khi ngâm 36 ngày, kết quả ở các nghiệm thức như sau nghêu được ngâm với bào tử động chết 100%, cường độ nhiễm 200-1.500 bào tử/cá thể, tỷ lệ nhiễm 93 ± 4,7%; ngâm với bào tử nghỉ nghêu chết 100%, cường độ nhiễm 100-1.500 bào tử/cá thể, tỷ lệ nhiễm 80 ± 0%. Từ khóa: bào tử động, bào tử nghỉ, cảm nhiễm, Meretrix lyrata, Perkinsus olseni ABSTRACT The study was conducted for the purpose of infected by Perkinsus olseni on Ben Tre clam (Meretrix lyrata) in experimental conditions. Clams were soaked in 3 liters of sea water containing zoospores (2x105 spores/ ml), hypnospores (13 spores/ml) of P. olseni and control treatment not containing spores. After soaking for 36 days, clams soaked with zoospores had mortality at 100%, infection intensity 200-1,500 spores/individuals, prevalence of 93 ± 4.7%; clams soaked with hypnospore had mortality at 100%, intensity of infection 100-1,500 spores/individual, rate of infection 80 ± 0%. Keywords: zoospore, hypnospore, infection, Meretrix lyrata, Perkinsus olseni I. ĐẶT VẤN ĐỀ Động vật thân mềm hai mảnh vỏ là nhóm động vật có tầm quan trọng về kinh tế, tuy vậy cùng với sự phát triển của nghề nuôi thì dịch bệnh trên đối tượng này cũng xuất hiện và bùng phát mạnh hơn trên toàn thế giới. Bệnh trên động vật thân mềm đã xảy ra trên các đối tượng khác nhau (hàu, nghêu, trai) gây ra thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi ở nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Kí sinh trùng đơn bào nội ký sinh thuộc giống Perkinsus là một trong nhiều nguyên nhân đã gây ra dịch bệnh trên nghêu. Bệnh do kí sinh trùng đơn bào Perkinsus được ghi nhận gây thiệt hại nghiêm trọng nhất về mặt kinh tế trên phạm vi toàn cầu. Kí sinh trùng nội ký sinh này đã được báo cáo gây ra tỷ lệ chết cao và thường xuyên cho nhiều loài động vật thân mềm (hàu, điệp, bào ngư, nghêu, vẹm, sò huyết và trai ngọc) nước mặn có giá trị ở tất cả các châu lục [11]. Cảm nhiễm bởi Perkinsus sp. gây hoại tử mô, giảm tăng trưởng, giảm khả năng sinh sản, giảm sự tích trữ năng lượng của mô vật chủ, và gây ra tỷ lệ chết cao và thường xuyên cho vật chủ [7, 9]. 1 Viện Nuôi trồng Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 23
Các loài Perkinsus có vòng đời tương tự nhau với 3 giai đoạn biến thái chính, bao gồm: thể dinh dưỡng (Trophozoite), bào tử nghỉ (Hypnospore) và bào tử động (Zoospore). Giai đoạn thể dinh dưỡng xảy ra trong các mô của vật chủ còn sống. Nó là một tế bào hình cầu với một không bào chiếm diện tích lớn trong tế bào và nhân tế bào ngoại vi nên được gọi là tế bào nhẫn [11], dinh dưỡng tăng sinh trong mô và tiến hành phân chia bên trong tế bào vật chủ. Giai đoạn bào tử nghỉ xuất hiện ở mô của vật chủ bị nhiễm Perkinsus được ủ trong dung dịch Fluid Thioglycolate Medium (FTM) [11] giai đoạn này, thể dinh dưỡng của chúng mở rộng, thành tế bào phát triển dày lên, hình thành một giai đoạn phát triển mới gọi là bào tử nghỉ. Khi bào tử nghỉ được hình thành trong môi trường FTM sẽ được phân lập và chuyển vào trong môi trường nước biển, và quá trình hình thành bào tử động bắt đầu. Giai đoạn bào tử động xuất hiện trong nước biển. Hàng trăm bào tử động sẽ hình thành và được phóng thích ra môi trường ngoài thông qua một hoặc hai ống nhỏ. Ống này sẽ xuất hiện trên mỗi bào tử nghỉ trước khi quá trình phân chia tế bào hình thành bào tử động bên trong diễn ra [4, 6, 8]. Bào tử động mới sử dụng roi để di chuyển vào vật chủ và lặp lại chu kỳ sống của chúng. Tất cả các giai đoạn biến thái trong vòng đời của Perkinsus olseni đều có thể gây bệnh cho động vật thân mềm [3]. Ở Việt Nam, từ đầu năm 2003 cho đến nay, hiện tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ nói chung và nghêu nói riêng liên tục chết hàng loạt trên diện rộng tại nhiều địa phương nhưng chưa rõ nguyên nhân đang trở thành vấn đề quan tâm của người nuôi, nhà khoa học và nhà quản lý. Các nghiên cứu về bệnh trên nghêu, đặc biệt là bệnh do P. olseni còn hạn chế. Hầu hết các kết quả nghiên cứu mới dừng lại ở mức độ mô tả sự hiện diện của ký sinh trùng và đánh giá mức độ nhiễm của chúng trên các đối tượng động vật thân mềm [1, 2]. Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh và đường truyền lây của P. olseni hầu như chưa được nhắc đến. Do đó, việc thử nghiệm cảm nhiễm bào tử ký sinh trùng P. olseni bằng phương pháp ngâm sẽ tạo điều kiện thuận lợi hơn cho các nghiên cứu chuyên sâu trong điều kiện thí nghiệm. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Nghêu sạch bệnh có nguồn gốc từ huyện Hòa Bình, tỉnh Bạc Liêu, kích cỡ từ 30-50mm chiều dài. Sau thời gian thuần dưỡng từ 3-4 ngày, 20% số lượng cá thể được thu để phân tích tỷ lệ và cường độ nhiễm Perkinsus olseni theo phương pháp của Ray (1952). Quần thể sạch bệnh đạt yêu cầu để thí nghiệm khi có cường độ nhiễm P. olseni là 0 bào tử/cá thể và tỷ lệ nhiễm là 0%. Các cá thể thí nghiệm được cho ăn hỗn hợp tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana với tỷ lệ 1 : 1 về thể tích. Tần suất cho ăn là 2-3 lần/ngày với mật độ tảo là 7-10 x 10 5 tế bào/ml. Bào tử nghỉ P. olseni được chuẩn bị theo phương pháp của Shimokawa et al (2010). Bào tử nghỉ được thu từ nghêu nhiễm P. olseni tại Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 2/2016. Nghêu được nuôi cấy nguyên con trong môi trường FTM có bổ sung Cloramphenicol (200 µg/ml) và Nystatin (200 IU/ml) trong điều kiện tối ở nhiệt độ phòng trong 7-9 ngày. Cơ nghêu đã nuôi cấy được ly tâm (5.000 vòng/phút, trong 10 phút), sau đó phân hủy bằng Trypsin 10% trong 90 phút ở nhiệt độ phòng. Bào tử nghỉ được lọc qua lưới lọc 300µm, sau đó rửa vài lần trong nước biển tiệt trùng. Bào tử động P. olseni được chuẩn bị bằng cách đặt bào tử nghỉ vào ống falcon (50 ml) chứa 30 ml nước biển có nhiệt độ 25ºC, độ mặn 25, ph 7,5-8. Khi sự có mặt của bào tử động được quan sát, chúng sẽ được ly tâm thu sinh khối trước khi tiêm cho nghêu. 24 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Hình 1. Vật liệu nghiên cứu (A: Nghêu; B: Bào tử nghỉ P. olseni giai đoạn 1 tế bào; B: Bào tử nghỉ P. olseni giai đoạn n tế bào) 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Bố trí thí nghiệm Khoảng 2 x 10 5 bào tử động/ml và 13 bào tử nghỉ/ml của Perkinsus olseni được cho vào nước biển trong thùng xốp, thể tích nước là 3 lít chứa 10 cá thể nghêu không bị nhiễm P. olseni. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Ở nghiệm thức đối chứng, nghêu được ngâm với nước biển 25 đã được xử lý. Hệ thống thí nghiệm không sục khí suốt quá trình thí nghiệm. Nghêu không được cho ăn để kích thích quá trình lọc nước. Nghêu chết được thu mẫu phân tích cường độ nhiễm Perkinsus bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường FTM. 2.2. Theo dõi yếu tố môi trường Các yếu tố môi trường gồm nhiệt độ, ph được theo dõi vào 7:00-8:00 h và 14:00-15:00 h hằng ngày. Trong đó, nhiệt độ được đo bằng nhiệt kế với độ chính xác 1ºC, ph được đo bằng máy đo ph Consort - C3010, độ mặn ( ) sử dụng tỷ trọng kế với độ chính xác 1 trước khi cấp nước vào thùng xốp trước khi tiến hành thí nghiệm và khi thay nước (nước được thay hằng ngày từ 20-100% tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi). 2.3. Phân lập Perkinsus Phương pháp nuôi cấy nguyên con được dùng để kiểm tra cường độ nhiễm P. olseni của nghêu trước và sau khi tiến hành thí nghiệm. Khối mô nuôi cấy được cắt nhỏ và ủ trong các falcon chứa 20 ml môi trường FTM có bổ sung Cloramphenicol (200µg/ml) và Nystatin (200IU/ ml). Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối, yếm khí. Sau 7 ngày nuôi cấy, bào tử P. olseni được nuôi cấy bằng cách ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ môi trường FTM. Phần thịt nghêu được phân hủy bằng NaOH 2M ở 60 0 C để tách bào tử nghỉ khỏi tổ chức mô của nghêu. Quá trình được thực hiện vài lần cho đến khi phần cơ được tiêu hủy hoàn toàn. Bào tử được đếm số lượng để tính cường độ nhiễm bằng kính hiển vi quang học ở 40x. Phương pháp tính Tỷ lệ nhiễm (%) là phần trăm số cá thể nhiễm bệnh ký sinh trùng Perkinsus olseni so với số cá thể kiểm tra. Cường độ nhiễm (bào tử/cá thể) là số lượng bào tử P. olseni trên một cá thể kiểm tra. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tỷ lệ chết tích lũy khi ngâm nghêu không bị nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni trong nước có chứa bào tử động và bào tử nghỉ được thể hiện qua Hình 2. Hình 2. Tỷ lệ chết cộng dồn của nghêu cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 25
Sau 36 ngày của thí nghiệm, tỷ lệ chết tích lũy của nghiệm thức đối chứng là 46,67%, ngâm với bào tử động và bào tử nghỉ là 100%. Nghêu tại các đơn vị thí nghiệm chết rải rác bắt đầu từ ngày thứ 6 sau khi ngâm. Ở cả hai thí nghiệm, nghêu được ngâm bào tử nghỉ hay bào tử động đầu chết tập trung nhiều vào ngày 12-18 sau khi gây nhiễm. Nghêu chết ở các nghiệm thức không nhận thấy các dấu hiệu bệnh lý đặc trưng xuất hiện trên các cơ quan của nghêu, mà chỉ nhận thấy khả năng lọc thức ăn của nghêu giảm và tiết nhớt. Sau 36 ngày thí nghiệm ngâm nghêu với bào tử động và bào tử nghỉ, nghêu có kết quả về cường độ nhiễm lần lượt là 1.314 ± 121,5 bào tử/cá thể và 1.050 ± 212,1 bào tử/cá thể (Bảng 1). Cường độ nhiễm nằm trong khoảng từ 200-1.500 bào tử/cá thể và tỷ lệ cảm nhiễm là 93 ± 4,7% khi ngâm với bào tử động; cường độ nhiễm 100-1.500 bào tử/cá thể và tỷ lệ nhiễm là 80 ± 0% khi ngâm bào tử nghỉ. Sau 9 ngày ngâm bào tử động, nhận thấy có bào tử ký sinh trùng P. olseni trong mô nghêu nuôi cấy FTM và sau 11 ngày đối với bào tử nghỉ. Cường độ nhiễm ký sinh trùng tăng theo thời gian thí nghiệm ở cả hai nghiệm thức. Bảng 1. Cường độ nhiễm của nghêu Số liệu diễn giải giá trị trung bình ± sai số chuẩn Thời gian sau khi Cường độ nhiễm (bào tử/cá thể) ngâm (ngày) Bào tử động Bào tử nghỉ Đối chứng 6 0 0-12 175 ± 125,8 57 ± 78,7 0 18 588 ± 172,7 333 ± 88,8 0 24 767 ± 186,2 857 ± 382,3 0 30 825 ± 485,6 1.050 ± 212,1 0 36 1.314 ± 121,5-0 Thực tế, các loài ký sinh trùng có thể tiếp cận và gây bệnh cho các vật chủ thông qua con đường thức ăn hoặc được hấp thụ qua mang và màng áo [11]. Chính vì vậy, gây nhiễm Perkinsus bằng phương pháp ngâm đã được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng trên hàu C. virginica [11], nghêu M. lyrata [2], nghêu Manila [10]. Các nghiên cứu này là cơ sở để chúng tôi dùng phương pháp ngâm để gây nhiễm P. olseni cho nghêu M. lyrata. Theo báo cáo từ các nghiên cứu trước đây, bào tử nghỉ hay bào tử động của Perkinsus đều có khả năng gây hại cho động vật thân mềm trong điều kiện thí nghiệm. Cụ thể, Ngô Thị Ngọc Thủy (2011) đã cho thấy nghêu M. lyrata khi được ngâm 146 bào tử/ml, 73 bào tử/ml, 36,5 bào tử/ml đã có tỷ lệ nhiễm lần lượt là 51,82%, 22,54% và 36,07%. Shimokawa et al (2010) cũng xác định khả năng gây nhiễm của túi bào tử động P. olseni trên nghêu Manila bằng phương pháp ngâm trong 6 ngày. Tác giả đã chỉ ra liều gây chết của loại ký sinh trùng này là khoảng 10 7 bào tử/g thịt nghêu. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 1 và Hình 1 cũng cho thấy cường độ nhiễm sau khi cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm, bào tử động có cường độ nhiễm (1.314 ± 121,5 bào tử/cá thể) cao hơn so với ngâm bào tử nghỉ (1.050 ± 212,1 bào tử/cá thể). Nghêu ngâm với bào tử nghỉ có thời gian chết sau khi gây nhiễm với tỷ lệ 100% sớm hơn (30 ngày) so với bào tử động (36 ngày). Ký sinh trùng nội ký sinh phải vượt qua rất nhiều rào cản và chịu đựng sự loại thải, tiêu diệt của hệ miễn dịch để có thể gây bệnh cho vật chủ [5]. Theo các nhà nghiên cứu, tất cả các giai đoạn biến thái trong vòng đời của P. olseni đều có thể gây bệnh cho động vật thân mềm [3]. Điều này đã được chứng minh bằng các thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm bằng thể dinh dưỡng, bào tử nghỉ và bào tử động Perkinsus spp. trên hàu [5]. 26 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Hàu được tiêm P. marinus thể dinh dưỡng dẫn đến tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm cao hơn hàu tiêm bào tử nghỉ tuy nhiên khi xét đến sự thay đổi các chỉ tiêu sinh học thì bào tử nghỉ gây ra những biến đổi lớn hơn so với thể dinh dưỡng. Nghiên cứu này cũng đã cho thấy bào tử nghỉ hay bào tử động của P. olseni đều có khả năng gây nhiễm cho nghêu M. lyrata. Chintala et al (2002) đã thí nghiệm cảm nhiễm P. marinus của hàu Crassostrea virginica bằng các phương pháp cho ăn, tiêm vào xoang màng áo, đặt ống trong ruột và tiêm cơ khép vỏ với mật độ P. marinus ban đầu là 10 6 tế bào pha log/g mô ướt. Kết quả cho thấy cường độ nhiễm ký sinh trùng giảm dần theo các phương pháp tiêm vào cơ khép vỏ, xoang màng áo, đặt ống trong ruột và cho ăn. Ngoài ra, thí nghiệm cũng cho thấy màng áo, mang và ruột chính là cơ quan nhiễm P. marinus đầu tiên của hàu C. Virginica. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Ký sinh trùng Perkinsus olseni có thể cảm nhiễm lên nghêu bằng phương pháp ngâm khi sử dụng bào tử động và bào tử nghỉ. Nghiên cứu chỉ sử dụng một phương pháp để cảm nhiễm, do đó, để có thể tìm ra phương pháp hiệu quả nhất để gây nhiễm ký sinh trùng P. olseni trên nghêu còn cần những nghiên cứu với các phương pháp cảm nhiễm khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Ngô Thị Thu Thảo, 2008. Một số đặc điểm của ký sinh trùng Perkinsus sp. Lây nhiễm trên nghêu lụa Paphia undulata ở Kiên Giang và Bà Rịa - Vũng Tàu. Tạp chí Khoa học. Trường Đại học Cần Thơ, 2008 (1), 222-230. 2. Ngô Thị Ngọc Thủy 2011. Điều tra, nghiên cứu bệnh trên một số đối tượng nhuyễn thể nuôi tại vùng ven biển Cà Mau Việt Nam. Tiếng Anh 3. Aswani, K & Chu, FLE, 1994. Comparison of infectivity of pathogenicity of meront and Prezoosporangiae stages of the oyster pathogen Perkinsus marinus in eastern oysters, Crassostrea virginica. Journal of Shellfish Research, 13(2), 521-527. 4. Azevedo, C, 1989. Fine structure of Perkinsus atlanticus n. sp. (Apicomplexa, Perkinsea) parasite of clams, Ruditapes decussatus, from Portugal. Journal of Parasitology, 75, 627-635. 5. Chintala, MM, David, B & Susan, EF, 2002. Comparison of in vitro-cultured and wild-type Perkinsus marinus. II. Dosing methods and host response. Deseases of aquatic organisms, 51, 203-216. 6. Lester, RJG & Davis, GHG 1981. A new Perkinsus species (Apicomplexa, Perkinsea) from the abalone Haliotis ruber. Journal of Invertebrate Pathology, 37, 181-187. 7. Mackin, JG & Hopkins, SH 1962. Studies on oyster mortality in relation to natural environments and to oil fields in Louisiana, University of Texas Institute of Marine Science. 8. McLaughlin, MS, Tall, DB, Shaheen, A, Elsayed, EE & Faisal, M 2000. Zoosporulation of a new Perkinsus species isolated from the gills of the softshell clam Mya arenari. Parasite, 7, 115-122. 9. Park, KI & Choi, KS 2001. Spatial distribution of the protozoan parasite Perkinsus sp. found in the Manila clams, Ruditapes philippinarum, in Korea. Aquaculture, 203, 9-22. 10. Shimokawa, J, Yoshinaga, T & Ogawa, K 2010. Experimental evaluation of the pathogenicity of Perkinsus olseni in juvenile Manila clams Ruditapes philippinarum. Journal of Invertebrate Pathology, 105, 347-351. 11. Villalba, A, Casas, SM, Figueras, A, Ordás, CM & Reece, KS 2004. Perkinsosis in molluscs: A review. Aquatic Living Resources, 17, 411-432 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 27