BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN BÁ HƯNG VAI TRÒ CỦA TRÌNH TỰ AMINO ACID KỴ NƯ

Bản ghi

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN BÁ HƯNG VAI TRÒ CỦA TRÌNH TỰ AMINO ACID KỴ NƯỚC VÀ PHÂN CỰC ĐỐI VỚI CƠ CHẾ CUỐN PROTEIN VÀ SỰ KẾT TỤ CỦA PEPTIDE Chuyên ngành: Vật lý lý thuyết và vật lý toán Mã ngành: TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ HÀ NỘI 21

2 Công trình này được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Xuân Hoàng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại viện Khoa học và Công nghệ- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi... giờ, ngày... tháng... năm 21.. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam

3 TỔNG QUAN Trong các vấn đề của sinh học phân tử, vấn đề cuốn của protein luôn có được sự quan tâm hàng đầu. Hầu hết các protein chỉ thể hiện hoạt tính sinh học khi chúng nằm ở trạng thái cuốn với cấu trúc 3 chiều bó chặt và duy nhất cho mỗi protein, gọi là trạng thái tự nhiên (native state) của protein. Khi protein bị duỗi hoặc cuốn nhầm, chúng không chỉ mất đi các hoạt tính sinh học vốn có mà còn có thể kết tụ thành các cấu trúc dạng sợi không hòa tan gọi là amyloid, được biết là liên quan tới nhiều loại bệnh thoái hóa với tiến triển nghiêm trọng như Alzheimer, Parkinson, tiểu đường tuýp 2, các loại bệnh xốp não, bệnh bò điên v.v. Do vậy, việc xác định cấu trúc cuốn và làm rõ cơ chế cuốn của protein có vai trò to lớn đối với hiểu biết của chúng ta về cơ thể sống cũng như đối với sức khỏe con người. Hiện tượng kết tụ protein và sự hình thành amyloid cũng được nghiên cứu mạnh trong những năm gần đây. Các nghiên cứu dẫn đến giả thuyết cho rằng amyloid là trạng thái chung của mọi protein, và là trạng thái cơ bản của hệ khi các protein có thể hình thành các tương tác liên phân tử. Như vậy, xu hướng kết tụ và hình thành amyloid luôn tồn tại cho mọi protein, và là một xu hướng cạnh tranh với quá trình cuốn protein. Tuy vậy, các thí nghiệm cũng cho thấy rằng khả năng kết tụ và tốc độ kết tụ phụ thuộc vào các điều kiện dung môi và vào trình tự amino acid của các protein. Một số nghiên cứu cho thấy trong chuỗi protein có thể tồn tại các đoạn trình tự amino acid nhỏ có ảnh hưởng lớn tới khả năng kết tụ của cả protein. Do vậy, việc nghiên cứu để tìm ra mối liên hệ giữa trình tự amino acid và khả năng kết tụ là rất cần thiết, có ý nghĩa cơ bản trong việc tìm hiểu các bệnh liên quan tới amyloid cũng như tìm ra phương hướng để chữa trị các loại bệnh này. Mặc dù các phương pháp mô phỏng với tất cả các nguyên tử (all-atom simulations) hiện nay được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu về các hệ sinh học phân tử, việc áp dụng các phương pháp này trong nghiên cứu cuốn protein là không khả thi do giới hạn của tốc độ máy tính. Một cách tiếp cận phù hợp đối với vấn đề cuốn protein đó là dùng các mô hình lý thuyết đơn giản. Có khá nhiều mô hình với các ý tưởng và mức độ đơn giản hóa khác nhau, tuy nhiên đáng kể nhất là mô hình Go và mô hình mạng HP và mô hình ống. Các nghiên cứu về polymer dạng ống gợi ý rằng tính chất đối xứng dạng ống là đặc trưng cơ bản của phân tử protein, giúp hình thành nên các cấu trúc bậc hai của protein (xoắn α và phiến β). Trên cơ sở của ý tưởng này, mô hình ống 1

4 cho protein được phát triển bởi Hoàng cùng nhóm nghiên cứu của Maritan, và được đề xuất vào năm 24. Các kết quả của mô hình ống cho thấy đây là một mô hình đơn giản nhưng mô tả tốt nhiều đặc trưng cơ bản của protein. Mô hình ống cũng là mô hình duy nhất hiện nay có thể đồng thời sử dụng cho nghiên cứu cả quá trình cuốn và quá trình kết tụ. Trong luận án này, chúng tôi sử dụng mô hình ống để nghiên cứu ảnh hưởng của trình tự amino acid lên sự cuốn và sự kết tụ của protein. Tính chất lấp đầy không gian của polymer dạng ống và các liên kết hydro trong mô hình đóng vai trò các tương tác nền, không phụ thuộc vào trình tự amino acid. Trình tự amino acid được chúng tôi xem xét trong mô hình đơn giản hóa chỉ gồm 2 loại amino acid, kỵ nước (H) và phân cực (P). Để nghiên cứu ảnh hưởng của trình tự HP lên quá trình cuốn, chúng tôi sẽ so sánh tính chất cuốn của mô hình ống sử dụng tương tác kỵ nước với trình tự HP (mô hình ống HP) với mô hình ống sử dụng các tương tác cặp giống như trong mô hình Go (mô hình ống Go). Việc so sánh này giúp làm rõ hơn vai trò của các tương tác cặp kỵ nước không xuất hiện trong trạng thái tự nhiên (non-native interactions). Để nghiên cứu vai trò của trình tự HP lên sự kết tụ của protein, chúng tôi sẽ so sánh khả năng kết tụ của các chuỗi peptide với các trình tự HP khác nhau, bao gồm việc xem xét tới hình dạng của các cấu trúc kết tụ và tính chất của quá trình chuyển pha kết tụ. Ngoài ra, trong nghiên cứu về sự kết tụ của protein chúng tôi đề xuất một mô hình cải tiến cho tương tác kỵ nước trong mô hình ống, có xét tới tính định hướng của các chuỗi bên của các amino acid kỵ nước. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mô hình cải tiến này cho phép thu được các cấu trúc kết tụ có trật tự cao và có dạng sợi dài giống như sợi amyloid. 1. Mục đích nghiên cứu: ˆ Làm rõ ảnh hưởng của trình tự HP lên tính chất cuốn của protein. ˆ Làm rõ vai trò của trình tự HP lên sự kết tụ của protein và sự hình thành sợi amyloid. 2. Kết cấu của luận án: Nội dung luận án được chia làm 5 chương không kể các phần mở đầu, kết luận và tài liệu tham khảo. Chương 1 giới thiệu tổng quan về vấn đề cuốn protein. Chương 2 giới thiệu tổng quan về hiện tượng kết tụ protein và sự hình thành amyloid. Chương 3 đề cập đến các mô hình, phương pháp mô phỏng và phương pháp xử lý số liệu. Chương 4 trình bày kết quả nghiên cứu về vai trò của trình tự HP đối với cuốn protein. Chương 5 trình bày kết quả nghiên cứu vai trò của trình tự HP đối với sự kết tụ của peptide. 2

5 Chương 1 Sự cuốn của protein 1.1 Các đặc trưng cấu trúc của protein Protein là các đại phân tử được tổng hợp bởi tế bào và chịu trách nhiệm cho hầu hết các hoạt động sinh học của tế bào. Chúng là những hợp chất hữu cơ cao phân tử (polymer) được tạo thành từ các đơn phân (monomer) gồm 2 loại amino acid khác nhau. Các amino acid trong protein chỉ khác nhau ở chuỗi bên (side chain) của chúng và liên kết với nhau thông qua các liên kết peptide tạo thành một chuỗi tuyến tính theo một trình tự cụ thể. Ở các điều kiện bình thường của cơ thể sống phần lớn các protein nằm ở một trạng thái có cấu trúc ba chiều gói chặt và duy nhất cho mỗi protein, được gọi là trạng thái tự nhiên (native state) hoặc trạng thái cuốn (folded state) của protein. Hoạt tính sinh học của protein chỉ được thể hiện khi nó nằm ở trạng thái cuốn. Trình tự amino acid trong protein quyết định cấu trúc và chức năng của protein. Protein có 4 dạng cấu trúc. Cấu trúc bậc một của protein và chuỗi peptide được xác định bởi trình tự tuyến tính của amino acid (a.a). Các a.a trong chuỗi liên kết hóa học với nhau bởi liên kết peptide. Cấu trúc bậc hai là là sự sắp xếp định xứ không gian của các acid amin. Có hai loại cấu trúc bậc hai cơ bản đó là xoắn α (α-helix)và dạng phiến β (β-sheet). Cả hai cấu trúc dạng này đều nhằm làm bão hòa các liên kết hydro có thể xuất hiện của mạch chính. Cấu trúc bậc ba là sự sắp xếp trong không gian của toàn bộ chuỗi polypeptide hình thành do sự tương tác giữa các chuỗi bên, trong đó các xoắn α và phiến β có thể cuộn lại với nhau thành từng vùng (domain) có nhiều vòng và nếp gấp, tạo thành hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Một số protein có thể gồm vài chuỗi polypeptide với các cấu trúc bậc ba riêng biệt. Khi đó sự sắp xếp không gian của các cấu trúc bậc ba trong protein được gọi là cấu trúc bậc bốn Cấu trúc protein được ổn định bởi tương tác giữa các amino acid, bao gồm liên kết hydro, tương tác van der Waals, tương tác kỵ nước. 3

6 1.2 Hiện tượng cuốn protein Quá trình cuốn protein là quá trình vật lý ở đó chuỗi polypeptide cuộn gấp thành cấu trúc ba chiều đặc trưng, có chức năng sinh học từ cuộn ngẫu nhiên. Cấu trúc 3 chiều của protein được xác định hoàn toàn bởi trình tự amino acid (giả thuyết nhiệt động lực học) 1.3 Nghịch lý Levinthal Bằng cách nào đó protein có thể tìm thấy trạng thái gốc của mình trong một thời gian có ý nghĩa về mặt sinh học? Nghịch lý Levinthal chỉ ra rằng quá trình cuốn của protein không thể là quá trình tìm kiếm ngẫu nhiên. 1.4 Phễu cuốn Dựa trên những kết quả nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm, Onuchic và các cộng sự đã đưa ra ý tưởng về phễu cuốn (folding funnel) như được mô tả ở hình 1.1. Quá trình cuốn protein trong phễu cuốn là quá trình giảm đồng thời cả năng lượng và entropy. Khi protein bắt đầu cuốn, năng lượng tự do giảm xuống và số cấu hình giảm xuống (đặc trưng bởi bề rộng giếng giảm). entropy folding energy Hình 1.1: Địa hình năng lượng cuốn protein có dạng phễu N 4

7 Hình 1.2: Sơ đồ năng lượng tự do trong mô hình hai trạng thái. D, N, lần lượt là trạng thái duỗi, trạng thái gốc, F N, F D, F lần lượt là độ cao của các bờ thế xuất phát từ các trạng thái duỗi và cuốn và độ chênh lệch năng lượng tự do duỗi cuốn 1.5 Nguyên lý thất vọng tối thiểu Nguyên lý thất vấp tối thiểu được đưa ra vào năm 199 bởi Bryngelson và Wolynes dựa trên lý thuyết về spin glass. Nguyên lý này cho rằng trình tự amino acid của protein trong tự nhiên được tối ưu hóa thông qua quá trình chọn lọc tự nhiên sao cho sự vấp gây bởi xung đột tương tác trong trạng thái tự nhiên là nhỏ nhất. 1.6 Mô hình hai trạng thái cho cơ chế cuốn protein Các quan sát từ thực nghiệm cho thấy hầu hết các protein nhỏ hình cầu cuốn theo cơ chế hai trạng thái. Các protein nhỏ, đơn miền với giả định rằng protein chỉ có thể nằm ở một trong hai trạng thái cuốn (N) hoặc duỗi (D). Giữa hai trạng thái duỗi và cuốn tồn tại hàng rào thế ngăn cách giữa chúng. Độ ổn định của trạng thái cuốn hay năng lượng tự do cuốn (folding free energy) đặc trưng bởi chênh lệch năng lượng tự do giữa hai trạng thái cuốn, duỗi F. Tốc độ cuốn k f, duỗi k u phụ thuộc vào độ chênh lệch năng lượng tự do này và tuân theo định luật van t Hooff-Arrhennius: ( k f,u = ν exp F ) N,D k B T (1.1) Với ν là hằng số, T là nhiệt độ và k B là hằng số Boltzmann. Các yếu tố như nhiệt độ, áp suất, nồng độ chất làm duỗi có thể ánh hưởng đến F. 5

8 1.7 Tính hợp tác của quá trình cuốn Tính hợp tác (cooperativity) là hiện tượng được mô tả bởi hệ bao gồm các yếu tố giống nhau hoặc gần giống nhau mà hoạt động phụ thuộc lẫn nhau. Quá trình cuốn là quá trình có tính hợp tác cao. Trong cuốn protein, tính hợp tác được dùng đối với quá trình cuốn hai trạng thái và được hiểu là độ sắc nét của quá trình chuyển pha cuỗn duỗi. Trong thực nghiệm, tính hợp tác được xác định thông qua thông số đo bởi tỉ số giữa enthapy van t Hoff và enthalpy nhiệt. κ 2 = H vh / H cal (1.2) Tính hợp tác cao đồng nghĩa với hệ thỏa mãn tốt tiêu chuẩn hai trạng thái và κ 2 càng gần 1 thì tính hợp tác càng cao và ngược lại. 1. Tương tác kỵ nước Hiện tượng co cụm và tránh tiếp xúc với nước của các phân tử không bị phân cực (như dầu, mỡ) được biết đến từ lâu với tên gọi là hiệu ứng kỵ nước (hydrophobic effect). Kết quả tương tác kỵ nước là sự liên kết giữa các phần tử kỵ nước. Các a.a phân cực có xu hướng xuất hiện trên bề mặt của protein để tiếp xúc với nước. Tương tác kỵ nước được cho là lực dẫn dắt (driving force) cho sự cuốn của protein 1.9 Mô hình HP mạng Trong mô hình mạng HP các acid amin được phân chia thành một trong hai loai kỵ nước (H-hydrophobic) hoặc phân cực (P-Polar) và sự cuốn của chuỗi protein được định nghĩa như bước đi ngẫu nhiên trong mạng 2D hoặc 3D. Sử dụng mô hình Dill đã thiết kế được trình tự chuỗi mà trạng thái có năng lượng cực tiểu trong các cấu hình gói chặt là duy nhất. Quá trình chuyển pha của các trình tự được thiết kế có tính kết hợp tốt. Nghiên cứu chỉ ra sự co cụm do tương tác kị nước là động lực chính dẫn dắt quá trình cuốn. 1. Mô hình Go Mô hình Go bỏ qua sự chuyên biệt của các trình tự amino acid trong chuỗi protein và xây dựng thế năng tương tác dựa trên cấu trúc của trạng thái cuốn. Cơ sở của mô hình Go chính là nguyên lý nhất quán tối đa giữa các tương tác của 6

9 protein ở trạng thái cuốn. Các kết quả nghiên cứu cho thấy mô hình Go cho cơ chế cuốn phù hợp khá tốt với thực nghiệm, đặc biệt là trong việc xác định đóng góp của các vị trí amino acid trong chuỗi polypeptide vào trạng thái chuyển tiếp trong quá trình cuốn protein. Do là mô hình được xây dựng dựa trên cấu trúc trạng thái native, mô hình Go không thể phỏng đoán cấu trúc protein từ trình tự amino acid mà chỉ được dùng để nghiên cứu quá trình cuốn về một cấu trúc đã biết Mô hình ống Các nghiên cứu về giản đồ pha trạng thái gốc tại không độ đối với các chuỗi homopolymer chiều dài L, bề dày, khoảng tương tác hút R của Banavar cho thấy các pha thu được phụ thuộc vào mối tương quan giữa /R và L/R. Hoàng và các cộng sự chỉ ra các cấu trúc thu được phụ thuộc vào tương quan giữa các tham số năng lượng phạt e R và năng lượng kị nước e W. Những thay đổi tương đối nhỏ trong các tham số e W và e R dẫn đến sự khác biệt đáng kể trong cấu trúc gốc thu được đã nhấn mạnh vai trò quan trọng của tính không đồng nhất hóa học trong việc lựa chọn từ danh sách các trạng thái cuốn gốc. Mô hình chỉ ra địa hình năng lượng được tạc bởi các yếu tố hình học và đối xứng của protein. Sử dụng trình tự gồm 4 đơn phân acid amin các tác giả đã thiết kế được protein cuốn tới cấu trúc phù hợp cho trước, giống như cấu trúc protein tồn tại trong tự nhiên. Mô hình giải thích được sự hữu hạn và sự bảo toàn cấu trúc protein, vai trò của trình tự amino acid trong việc lựa chọn cấu trúc cuốn, sự tiến hóa trung hòa của protein. 7

10 2.1 Cấu trúc sợi amyloid Chương 2 Sự hình thành Amyloid Hình 2.1: Mô hình cấu trúc của các sợi Alzheimer s Abeta(1-42) có mã PDB là 2BEG (a) nhìn theo hướng trục sợi. (b) nhìn theo hướng vuông góc trục sợi. Các sợi amyloid đều có chung cấu trúc phiến β chéo (cross-β sheet structure) ở vùng lõi với các dãy β nằm song song và vuông góc với trục sợi (hình 2.1). Các tương tác lặp đi lặp lại giữa các nhóm kỵ nước và phân cực dọc theo theo trục sợi. Đa số các sợi amyloid có vùng lõi bao gồm từ hai tới bốn phiến β tương tác gần với nhau. 2.2 Cơ chế hình thành sợi amyloid Thông thường quá trình hình thành amyloid gồm ba pha: pha trễ - lag phase, pha kéo dài elongation và pha bão hòa saturation phase. Các nghiên cứu cho thấy các cấu trúc được thêm vào một mẫu protein đang trong quá trình tập hợp sẽ làm pha chậm bị thu ngắn lại cho đến khi bị khử hẳn.

11 Chương 3 Các mô hình và phương pháp mô phỏng 3.1 Mô hình ống HP Mạch chính của protein được mô phỏng như một chuỗi của các nguyên tử C α được giữ cách nhau một khoảng xác định bằng 3, Å, tạo thành một ống linh hoạt có đường kính là 2.5Å đồng thời có một hạn chế với cả bán kính ba vật của ống (địa phương và phi địa phương). Thế năng 3 vật mô tả điều kiện này được cho bởi (Hình 3.1) { khi R ijk < V tube (i, j, k) = i, j, k (3.1) khi R ijk Thế năng bẻ cong trong mô hình ống liên quan tới các ràng buộc về không gian của chuỗi polypeptide. Thế năng bẻ cong tại vị trí i trong chuỗi được cho bởi (Hình 3.1) khi R i 1,i,i+1 < V bend (i) = e R khi R i 1,i,i+1 < 3.2 Å (3.2) khi R i 1,i,i Å. e R =.3 ɛ > với ɛ là đơn vị năng lượng ứng với năng lượng của một liên kết hydro địa phương. Trong mô hình ống, các liên kết hydro địa phương được tạo bởi các nguyên tử i và i + 3 và được gán cho năng lượng bằng ɛ. Các liên kết hydro phi địa phương được hình thành giữa các nguyên tử i và j > i + 4 và có năng lượng bằng.7 ɛ. Năng lượng và các ràng buộc hình học của một liên kết hydro địa phương giữa nguyên tử i và nguyên tử j được xác định như sau: j = i + 3 e hbond = ɛ 4.7 Å r ij 5.6 Å b i b j >. (3.3) b j c ij >.94 b i c ij >.94 (r i,i+1 r i+1,i+2 ) r i+2,i+3 >. 9

12 Local radius of curvature y r z Non local radius of curvature e e Hydrophobic interaction r r z y Hình 3.1: Minh họa những thế năng được sử dụng trong mô hình ống của protein. r, y là các bán kính cong địa phương, không địa phương; z là khoảng cách giữa hai đơn phân a.a; e R và e W tương ứng là năng lượng phạt, năng lượng tương tác kị nước (hydophobic) của một liên kết. Tương tự đối với một liên kết hydro phi địa phương: j > i + 4 e hbond =.7 ɛ 4.1 Å r ij 5.3 Å b i b j >. b j c ij >.94 b i c ij >.94. (3.4) Trong mô hình ống, tương tác kỵ nước được đưa vào dưới dạng thế năng tương tác cặp giữa các nguyên tử C α không liên tiếp nhau trong chuỗi (j > i + 1) cho bởi { e W r ij 7.5 V hydrophobic (i, j) = Å r ij > 7.5 Å, (3.5) e W kí hiệu năng lượng tương tác kị nước cho mỗi tiếp xúc, phụ thuộc vào tính kỵ nước của các amino acid i và j.trong phần lớn các nghiên cứu, các giá trị này được lựa chọn bằng e HH =.5 ɛ, e HP = e P P =. 3.2 Mô hình ống Go Mô hình ống Go là mô hình ống trong đó năng lượng tương tác kỵ nước được thay thế bởi năng lượng tương tác giống như trong mô hình Go (Go-like interaction): E = E bend + E hbond + E Go. (3.6)

13 Như vậy, mô hình ống Go vẫn giữ nguyên các tính chất hình học và đối xứng của mô hình ống cùng năng lượng bẻ cong và các liên kết hydro. Năng lượng tương tác kiểu Go được xây dựng dựa trên cấu trúc của trạng thái native được cho trước. Thế năng tương tác Go được cho bởi: { C ij e W r ij 7.5 V Go (i, j) = Å r ij > 7.5 Å, (3.7) trong đó C ij là các yếu tố của ma trận tiếp xúc native (native contact map). C ij = 1 nếu giữa i và j tồn tại tiếp xúc trong trạng thái native và C ij = trong trường hợp còn lại. Một tiếp xúc trong trạng thái native được định nghĩa khi khoảng cách giữa hai nguyên tử C α không liên tiếp nhau là nhỏ hơn 7.5 Å. 3.3 Mô hình ống với tính định hướng của các chuỗi bên Để nâng cao tính thực tế của thế năng tương tác kỵ nước, chúng tôi đưa vào điều kiện ràng buộc đối với sự định hướng của các chuỗi bên : n i c ij <.5 và n i c ij <.5. ở đây n i là vector pháp tuyến tại hạt thứ i và c ij là vector đơn vị hướng từ hạt i tới hạt j. Các ràng buộc mới này được dựa trên phân tích thống kê đối với các cấu trúc protein trong ngân hàng PDB 3.4 Các thông số cấu trúc protein Để nghiên cứu quá trình protein tiến về trạng thái native, chúng ta xét các tính chất của các cấu hình protein thu được từ mô phỏng thông qua một số đại lượng đặc trưng bao gồm số tiếp xúc cuốn, độ lệch căn quân phương và bán kính hồi chuyển. 3.5 Phương pháp mô phỏng Monte Carlo Để mô phỏng quá trình cuốn protein và kết cụm chuỗi peptide chúng tôi sử dụng phương pháp mô phỏng Monte Carlo (MC) với thuật toán Metropolis. Sự chuyển trạng thái của hệ trong các mô hình sử dụng được thực hiện nhờ các phép quay điểm (pivot), quay trục (crank-shaft) và tịnh tiến (tranlocation) đối với quá trình kết cụm protein và phép quay điểm, quay trục đối với quá trình cuốn protein. 11

14 3.6 Phương pháp điều nhiệt song song Phương pháp điều nhiệt song song hay Parallel tempering là phương pháp mô phỏng đưa ra để cải thiện tính chất động học của phương pháp mô phỏng MC của hệ vật lý, và phương pháp lấy mẫu chuỗi Markov MC tổng quát bằng cách tráo đổi các bản sao (replica) tại các nhiệt độ khác nhau. Sử dụng thuật toán Metropolis để tráo hai cấu hình k BA = min {1, exp [(β i β j ) (E i E j )]} (3.) Với k BA chính là xác suất chuyển từ A sang B. Phương pháp này rất hiệu quả để tìm trạng thái cơ bản đồng thời tại mỗi nhiệt độ vẫn thu được tập hợp cân bằng và chúng dễ dàng áp dụng trên các máy tính song song. 3.7 Phương pháp phân tích đa biểu đồ có trọng số Phương pháp phân tích đa biểu đồ có trọng số (WHAM) cho phép phân tích tối ưu dữ liệu thu được từ các mô phỏng theo phương pháp MC cũng như các mô phỏng khác trên một khoảng rộng các tham số bằng cách kết hợp nhiều histogram lại với nhau. Xắc suất tìm thấy hệ tại nhiệt độ T P (β k, E) = R N k (E) e β ke l=1 R n l exp [ β l E f l ] l=1 (3.9) f k = ln E P (E, β k ) (3.) Hệ 3.9 và 3. là hệ tự hợp. Giải hệ này bằng phương pháp lặp ta sẽ thu được giá trị k f. Xác định được các giá trị của f k ta hoàn toàn xác định được P (E, β) tại nhiệt độ bất kì:

15 Chương 4 Vai trò của trình tự amino acid kỵ nước và phân cực đối với cơ chế cuốn của protein Trong chương này chúng tôi nghiên cứu quá trình cuốn của protein trong hai mô hình: Mô hình ống HP và mô hình ống Go. Hai mô hình được lựa chọn sao cho trạng thái cuốn của protein trong cả hai mô hình là như nhau. Nghiên cứu được thực hiện với hai protein có cùng chiều dài N = 4. Protein thứ nhất có trạng thái cuốn có dạng bó tạo bởi 3 xoắn α, ký hiệu là 3HB. Protein thứ hai có trạng thái cuốn tạo bởi một xoắn α và một phiến β với 4 dải β, được ký hiệu là GB1. Hình 4.1 chỉ ra trạng thái gốc protein GB1 và 3HB. Hình 4.1: Cấu hình trạng thái gốc của protein 3HB (a), GB1 (b) Trong mô hình ống HP, e HH =.5ɛ, e HP = e P P = với ɛ là đơn vị năng lượng bằng độ lớn của năng lượng của 1 liên kết hydro địa phương. 4.1 Nhiệt động lực học cuốn protein trong mô hình ống HP Hình 4.2a c là đồ thị bán kính hồi chuyển trung bình, năng lượng trung bình và nhiệt dung riêng của protien 3HB phụ thuộc vào nhiệt độ trong mô hình ống HP. Năng lượng trung bình, bán kính hồi chuyển giảm khi nhiệt độ giảm. Đồ thị nhiệt dung riêng có cực đại C max = 1526k B tại T f =, 296ɛ/k B. Đồ thị có một bờ vai tại T.5 ɛ/k B tương ứng với sự giảm mạnh của bán kính hồi chuyển trung bình khi nhiệt độ giảm. Tại T.5 ɛ/k B xảy ra sự co giảm mạnh về kích thước của protein trong khi năng lượng không giảm nhiều. Sự thay đổi kích thước này của protein tương ứng với chuyển pha sụp đổ (collapse transition). Tương tự với protein GB1 (hình 4.2d f), đỉnh chuyển pha của nhiệt dung riêng của protein GB1 nằm ở nhiệt độ T f =.243 ɛ/k B và có độ cao C max = 59.7 k B, đều thấp hơn 13

16 <E> (units of ε) folding (a) 3HB <E> (units of ε) (d) folding GB1 <E> (units of ε) (a) 3HB <E> (units of ε) (d) GB <R g> (Angstroms) C (units of k B) 1 (b) collapse 3HB (c) 4 3HB T (units of ε/k B) <R g> (Angstroms) C (units of k B) 1 (e) collapse GB (f) GB T (units of ε/k B) <R g> (Angstroms) C (units of k B) 1 16 (b) 14 3HB (c) 3HB T (units of ε/k B) <R g> (Angstroms) C (units of k B) 2 1 (e) GB (f) 4 GB T (units of ε/k B) Hình 4.2: Đồ thị bán kính hồi chuyển R g, năng lượng E trung bình và nhiệt dung riêng của protein 3HB, GB1 trong mô hình ống HP phụ thuộc nhiệt độ Hình 4.3: Tương tự như hình 4.2 nhưng trong mô hình ống Go đáng kể so với 3HB,cho thấy chuyển pha cuốn của GB1 kém sắc nét và kém hợp tác hơn. Chuyển pha sụp đổ của GB1 sắc nét hơn so với 3HB. 4.2 Nhiệt động học cuốn protein trong mô hình ống Go Hình 4.3 là năng lượng trung bình, bán kính hồi chuyển trung bình và nhiệt dung riêng phụ thuộc vào nhiệt độ của protein 3HB và GB1 trong mô hình ống Go. Các quá trình chuyển pha cuốn và chuyển pha sụp đổ đều sắc nét hơn so với mô hình ống HP. Cho cả 2 protein, năng lượng trung bình và bán kính hồi chuyển trung bình đều có sự thay đổi mạnh tại vùng nhiệt độ chuyển pha với độ dốc lớn hơn so với mô hình ống HP. Nhiệt dung riêng chỉ có một đỉnh duy nhất tại nhiệt độ chuyển pha T f và đặc biệt không xuất hiện bờ vai ở vùng nhiệt độ lớn hơn nhiệt độ chuyển pha. Trong mô hình ống Go, chuyển pha sụp đổ xảy ra tại cùng nhiệt độ T f như chuyển pha cuốn. Pha sụp đổ trong mô hình ống Go cũng chính là pha cuốn. Mô hình ống Go có nhiệt độ chuyển pha cuốn T f cao hơn so với mô hình ống HP:.345 ɛ/k B so với.296 ɛ/k B cho protein 3HB và.291 ɛ/k B so với.243 ɛ/k B cho protein GB1. Đỉnh nhiệt dung riêng C max trong mô hình ống Go cũng cao hơn so với mô hình ống HP 2. lần (4269 k B so với 1526 k B cho protein 3HB) và 4.1 lần (24 k B so với 59.7 k B cho protein GB1). Các kết quả này cho thấy mô hình ống Go có tính hợp tác cuốn cao hơn rõ rệt so với mô hình ống HP. 14

17 - (d) E (units of ε) E (units of ε) (a) (a) (d) MC steps (x5).5.1 normalized histogram (b) rmsd (Angstroms) rmsd (Angstroms) (e) MC steps (x5) 5 15 MC steps (x5) (b).3.6 normalized histogram (e) normalized histogram 5 15 MC steps (x5).4. normalized histogram (c) (f) Rg (Angstroms) Rg (Angstroms) (c) (f) MC steps (x5) normalized histogram E (units of ε) MC steps (x5) (b) (e) 4 15 MC steps (x5) (d) MC steps (x5).3.6 normalized histogram 25 (b) 2 (e) normalized histogram 5 15 MC steps (x5).3.6 normalized histogram 2 24 (c) (f) MC steps (x5) normalized histogram (c) 24 (f) MC steps (x5) Hình 4.6: Quỹ đạo, biểu đồ chuẩn hóa thu được từ một mô phỏng dài 2 9 bước MC tại nhiệt đô chuyển pha Tf =.345 /kb của protein 3HB trong mô hình ống Go normalized histogram (a).2.4 normalized histogram rmsd (Angstroms) rmsd (Angstroms) 5 2 Rg (Angstroms) (d) Hình 4.5: Tương tự như hình 4.4 nhưng cho GB1 tại Tf =.243 /kb trong mô hình ống HP Rg (Angstroms) E (units of ε) (a) MC steps (x5) Hình 4.4: Quỹ đạo, biểu đồ chuẩn hóa thu được từ một mô phỏng dài 2 9 bước MC tại nhiệt đô chuyển pha Tf =.296 /kb của protein 3HB trong mô hình ống HP normalized histogram Hình 4.7: Tương tự như hình 4.6 nhưng cho GB1 tại Tf =.291 /kb trong mô hình ống Go Chuyển pha cuốn trong mô hình ống HP và mô hình ống Go Hình 4.4 và Hình 4.5 mô tả các quỹ đạo dài 2 9 bước MC tại nhiệt độ Tf =.296 /kb cho protein 3HB và Tf =.243 /kb cho protein GB1 trong mô hình ống HP. Năng lượng và rmsd biến thiên mạnh tại nhiệt độ chuyển pha, trong khi bán kính hồi chuyển Rg chỉ dao động xung quanh một giá trị trung bình. Cho 15

18 thấy sự tồn tại của pha cuốn ở các giá trị năng lượng và rmsd nhỏ, và pha không cuốn (duỗi) ở các giá trị năng lượng và rmsd lớn. Đối với protein 3HB, các biểu đồ phân bố năng lượng (Hình 4.4(d)) và độ dịch chuyển căn quân phương (Hình 4.4(e)) có hai đỉnh phân biệt giữa pha cuốn và pha duỗi còn biểu đồ phân bố bán kính hồi chuyển R g chỉ có một đỉnh (Hình 4.4(f)). Đối với protein GB1, các biểu đồ phân bố năng lượng và R g chỉ có một đỉnh (Hình 4.5(d,f)) nhưng biểu đồ phân bố rmsd vẫn có 2 đỉnh (Hình 4.5(e)). Các kết quả này cho thấy có sự tồn tại của 2 pha cuốn và duỗi cho cả 2 protein được xét, nhưng sự phân tách pha về mặt năng lượng của 3HB thể hiện rõ ràng hơn GB1. Các pha của cả 2 protein ở nhiệt độ chuyển pha cũng không có sự khác biệt về kích thước trung bình thể hiện bởi bán kính hồi chuyển. Giữa hai pha cũng tồn tại nhiều trạng thái trung gian. Hình 4.6 và Hình 4.7 mô tả các quỹ đạo thu được từ mô phỏng dài 2 9 bước MC trong mô hình ống Go cho 2 protein 3HB tại T f =.345 ɛ/k B và GB1 tại nhiệt độ T f =.291 ɛ/k B. Năng lượng, rmsd và R g của 2 protein đều biến thiên mạnh theo thời gian. Biểu đồ phân bố trạng thái theo năng lượng và rmsd có 2 đỉnh rõ ràng, biểu đồ phân bố theo R g có một đỉnh sắc nét ở giá trị nhỏ ứng với trạng thái cuốn và bờ vai rộng ở giá trị lớn. Sự phân tách 2 pha cuốn và duỗi trong mô hình ống Go thể hiện rõ nét hơn nhiều so với mô hình ống HP. Năng lượng tự do hiệu dụng tại một nhiệt độ T đã cho phụ thuộc năng lượng E và rmsd được định nghĩa là F (E, rmsd) = k B T log P (E, rmsd). Ở đây P (E, rmsd) là mật độ xắc suất xuất hiện protein ở trạng thái có năng lượng E và rmsd cho trước. Hình 4. mô tả năng lượng tự do tại T = T f cho các protein 3HB và GB1 trong mô hình ống HP và ống Go. Trong mô hình ống Go, năng lượng tự do chỉ gồm hai cực tiểu ứng thể hiện rõ tính chất 2 trạng thái của quá trình chuyển pha. Mô hình ống HP có bề mặt năng lượng tự do phức tạp hơn, gồm 3 cực tiểu trong trường hợp protein 3HB và 2 cực tiểu trong trường hợp protein GB1. Về cơ bản, bề mặt năng lượng tự do của 3HB trong mô hình ống HP vẫn có biểu hiện của một hệ 2 trạng thái do 2 cực tiểu của pha duỗi liên kết với nhau bởi 1 bờ thế thấp và có thể gộp làm một. Trong tất cả các trường hợp, giữa pha duỗi và pha cuốn luôn tồn tại một bờ thế năng lượng tự do. Pha duỗi của protein trong mô hình ống Go luôn có năng lượng cao, trong khi pha duỗi trong mô hình ống HP bao gồm các trạng thái có năng lượng nằm trong một khoảng rộng từ thấp tới cao. Sự tồn tại của các trạng thái duỗi với năng lượng thấp là hệ quả của trình tự HP trong mô hình ống HP, cho phép hình thành các tiếp xúc kỵ nước không tồn tại trong trạng thái cuốn. Đồng thời, nhiệt độ chuyển pha T f trong mô hình ống HP thấp hơn trong mô hình Go cũng giúp cho việc hình thành các liên kết hydro ở trạng thái duỗi dễ dàng hơn. 16

19 (a) (b) Rmsd Tube HP model: 3HB E Rmsd Tube Go model: 3HB E (c) (d) Rmsd Tube HP model: GB E Rmsd Tube Go model: GB E Hình 4.: Bề mặt hai chiểu của năng lượng tự do hiệu dụng phụ thuộc E, rmsd tại nhiệt đô chuyển pha: T f =.345 ɛ/k B, T f =.296 ɛ/k B đối với protein 3HB trong mô hình ống HP (a), ống Go (b) và T f =.291 ɛ/k B, T f =.243 ɛ/k B đối với prtoein GB1 trong mô hình ống Go (d), ống HP (c) So sánh mô hình ống HP và mô hình ống Go cho ta thấy việc thay đổi mô hình làm thay đổi trạng thái chuyển tiếp. Cụ thể là, đối với protein 3HB trạng thái chuyển tiếp nằm gần vị trí (E, rmsd) = ( 43 ɛ, 5.5Å) trong mô hình ống HP, và ( 24 ɛ, 5Å) trong mô hình ống Go. Đối với protein GB1, trạng thái chuyển tiếp nằm gần vị trí ( 26 ɛ, 5.Å) trong mô hình ống HP và ( 2 ɛ, Å) trong mô hình ống Go. Mặc dù vậy, có thể thấy là sự thay đổi trạng thái chuyển tiếp không lớn bằng sự thay đổi trạng thái duỗi khi chuyển từ mô hình ống HP sang mô hình Go. Điều này phù hợp với các kết quả nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm trước đây cho rằng cơ chế cuốn protein cũng như trạng thái chuyển tiếp phụ thuộc chủ yếu vào cấu trúc hình học của trạng thái cuốn 4.4 Ảnh hưởng cường độ tương tác kị nước lên quá trình cuốn Protein 3HB tiếp tục được sử dụng trong nghiên cứu này. Giá trị e HH biến đổi từ,15 đến,7. Hình 4. mô tả sự phụ thuộc nhiệt độ của nhiệt dung riêng phụ thuộc e HH. Khi e HH tăng, C max giảm, T f tăng. Các đồ thị đều có đỉnh sắc nét báo hiệu chuyển pha loại 1. Từ e HH =, 3ɛ đến e HH =, 7ɛ đồ thị đồ thị đều có đoạn bờ vai, nó mở rộng khi e HH tăng. Tại các giá trị e HH <.3 ɛ đoạn bờ vai không tồn tại hoặc rất nhỏ đề nhận ra trên đồ thị. 17

20 2 ε HH =-.7 ε HH =-.5 ε HH =-.3 ε HH =-.21 ε HH =-.2 ε HH = (b) (c) R g (units of A ) (a) (d) (e) T (units of ε/k B ) Hình 4.9: Các cấu trúc có năng lượng thấp nhất thu được từ mô phỏng protein 3HB với các cường độ tương tác kỵ nước khác nhau. Các cấu trúc hiển thị ứng với e HH =.2 ɛ (a), e HH =.21 ɛ (b), e HH =.3 ɛ (c), e HH =.5 ɛ (d), e HH =.7 ɛ (e). Hình 4.: Sự phụ thuộc của nhiệt dung riêng vào nhiệt độ của protein 3HB tại các giá trị cường độ tương tác kỵ nước khác nhau e HH =.2 ɛ,.3 ɛ,.5 ɛ và.7 ɛ. Hình 4.11 mô tả sự phụ thuộc của năng lượng trung bình E và bán kính hồi chuyển trung bình R g vào nhiệt độ. Năng lượng trung binh thay đổi mạnh tại nhiệt độ chuyển pha T f. Khi e HH >.2 ɛ, thì sự thay đổi của R g theo nhiệt độ có dạng đơn điệu. Sự thay đổi của R g theo nhiệt độ xảy ra chậm hơn và điểm uốn của đồ thị xảy ra ở nhiệt độ cao hơn khi e HH tăng. Điều này chứng tỏ khi e HH tăng chuyển pha sụp đổ xảy ra ở nhiệt độ cao hơn. Với e HH.2 ɛ, đồ thị bán kính hồi chuyển phụ thuộc vào nhiệt độ có dạng không đơn điệu: khi ở nhiệt độ thấp R g có giá trị lớn ứng với trạng thái cơ bản là xoắn α đơn; khi nhiệt độ tăng, xoắn đơn trở nên mất ổn định do dao động nhiệt và do đó R g giảm; khi nhiệt độ tiếp tục tăng, các liên kết hydro bị phá vỡ và cấu hình protein có dạng duỗi với kích thước tăng, dẫn tới R g tăng. Tính hợp tác cuốn vào cường độ tương tác kỵ nước thông qua việc xác định tỷ số giữa enthalpy van t Hoff và enthalpy nhiệt κ 2 = H vh / H cal. Giá trị κ 2 bằng, 5975 ±, 166;, 611 ±, 116;, 7267 ±, 26;, 7475 ±, 256 lần lượt cho ɛ HH =, 2;, 3;, 5;, 7. Kết quả trên cho thấy khi tương tác kỵ nước mạnh lên thì tính hợp tác cũng trở nên mạnh hơn biểu hiện qua giá trị κ 2 tăng. 1

21 2 <E> (units of ε) (a) e HH =-.19 e HH =-.2 e HH =-.21 e HH =-.3 e HH =-.5 e HH = e HH =-.19 e HH =-.2 e HH =-.21 e HH =-.3 e HH =-.5 e HH =-.7 <Rg> (Angstroms) (b) T (units of ε/k B ) Hình 4.11: Sự phụ thuộc của năng lượng trung bình E (a) và bán kính hồi chuyển trung bình R g (b) vào nhiệt độ của protein 3HB tại các giá trị cường độ tương tác kỵ nước khác nhau e HH =.19 ɛ,.2 ɛ,.21 ɛ,.3 ɛ,.5 ɛ,.7 ɛ. 19

22 Chương 5 Vai trò của trình tự amino acid kỵ nước và phân cực đối với sự kết tụ của peptide Chương này chúng tôi nghiên cứu sự kết cụm của chuỗi peptide ngắn trong mô hình ống HP bởi xem xét đến sự định hướng của chuỗi bên. Chúng tôi làm rõ ảnh hưởng trình tự chuỗi đến quá trình kết cụm hình thành cấu trúc β giống amyloid. Nghiên cứu được thực hiện với chuỗi peptide ngắn có độ dài N = a.a với số chuỗi biến đổi từ m = 1 đến m = 2. Các cấu trúc trạng thái gốc đối với hệ m = chuỗi có trình tự khác nhau chỉ ra trên hình 5.1 cho thấy cấu trúc thu được phụ thuộc vào số chuỗi và trình tự chuỗi. Chúng tôi phân tích sự kết cụm của các hệ gồm M peptide xác định với chiều dài của mỗi chuỗi là N = đơn phân có trình tự chuỗi của chúng được chỉ ra ở bảng Sự phụ thuộc của các cấu trúc kết tụ vào trình tự HP Hình 5.1 chỉ ra các cấu hình có năng lượng thấp nhất thu được từ mô phỏng. Trong đó hai hệ ứng với trình tự chuỗi có ký hiệu S2 và S11 tạo thành cấu trúc dạng phiến β hai lớp được tạo thành bởi các sợi nằm sắp xếp dọc theo nhau giống như cấu trúc β chéo của amyloid. Cấu trúc tương tự gần như cấu trúc sợi cũng được tìm thấy đối với chuỗi S với một vài phần của kết cụm không tồn tại ở dạng phiến-β. Các bó xoắn α được quan sát thấy trong kết cụm của hệ S3 và S4. Các cuộn xoắn của chuỗi S4 có cấu trúc trật tư hơn và có dạng tương tự như hình Bảng 5.1: Trình tự chuỗi amino acid của các peptide sử dụng trong nghiên cứu. Thông số s ký hiệu khoảng cách ngắn giữa hai amino acids. Sequence name Sequence s S1 P P P H H P P P 1 S2 P P H P H P P P 2 S3 P P H P P H P P 3 S4 P H P P P H P P 4 S5 P H P P P P H P 5 S6 H P P P P P H P 6 S7 H P P P P P P H 7 S P P H H H P P P 1 S9 P P H P H H P P 1 S P H P P H H P P 1 S11 P H P H P H P P 2 S P H P P H P H P 2 2

23 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S S9 S S11 S Hình 5.1: Các cấu hình trạng thái gốc của hệ chuỗi peptide có trình tự S1-S chỉ ra trong bảng I trụ trong đó các xoắn α gần như là song song với nhau. Vai trò của các đơn phân kỵ nước trong kết cụm có thể chỉ ra từ các cấu trúc của kết cụm. Sự sắp xếp của các chuỗi bên kỵ nước được quan sát thấy tốt nhất đối với chuỗi S2 và S11, ở đó các đơn phân kỵ nước được sắp thẳng hàng trong cùng mỗi phiến-β và chuỗi bên kỵ nước từ hai phiến-β sắp đối diện nhau. Sự sắp xếp này có khả năng liên quan đến kiểu mẫu HP H trong những chuỗi đó ở đó vị trí (sở hữu) chuỗi bên kỵ nước trên một mặt của mỗi phiến-β. Sự sắp hàng của các đơn phân kỵ nước cũng được tìm thấy trong trường hợp chuỗi S do chuỗi này cũng chứa kiểu mẫu HP H. Trong kết cụm α thu được từ các chuỗi S4 các chuỗi bên kỵ nước được thu thập dọc theo trục của cuộn liên quan đến sự sắp hàng của chuỗi bên kỵ nước dọc theo một mặt của mỗi xoắn α. Sự sắp hàng này liên quan đến kiểu mẫu HP P P H trong chuỗi S4. Mặt khác chuỗi S3 với kiểu mẫu HP P H cũng tạo thành kết cụm xoắn α nhưng các chuỗi bên kỵ nước không định hướng tốt trong xoắn, điều đó làm cho cấu trúc kết cụm trở nên kém trật tự. 5.2 Nhiệt động lực học của quá trình kết tụ Chúng tôi nhận thấy nhiệt dung riêng phụ thuộc mạnh cả vào trình tự chuỗi và kích thước hệ. Hình 5.2 và hình 5.3 chỉ ra sự phụ thuộc nhiệt độ của nhiệt dung riêng phân tử đối với các kích thước hệ khác nhau đối với trình tự S2 và S4. Đối với trình tự S2, đồ thị cho thấy khi M tăng đỉnh nhiệt dung riêng dịch chuyển về phía nhiệt độ cao đồng thời độ cao của nó tăng lên (Hình 5.2). Kết quả này cho thấy kết cụm trở nên ổn định hơn và chuyển pha trở nên hợp tác hơn khi kích thước hệ tăng. Đối với trình tự S4 kết cụm dạng bó xoắn, độ cao của đỉnh tăng theo M nhưng vị trí của đỉnh biến đổi không đơn điệu (hình 5.3 ). Chú ý rằng 21

24 M=1 M=2 M=3 M=4 M=5 M=1 M=2 M=4 C/M (k B ) M=1 M=2 M=3 M=4 M=5 M=6 M= M= T* S2 M=6 M= C/M (k B ) M=1 M=2 M=4 M=6 M= T* S4 M=6 M= T (ε/k B ) M= T (ε/k B ) Hình 5.2: Sự phụ thuộc nhiệt dung riêng cho của hệ S4 Hình 5.3: Tương tự như hình 5.2 nhưng cho hệ với trình với số chuỗi của hệ M lần lượt là 1, 2, 4, 6, và. Vị tự S4. Để quan sát được tốt, số lượng hệ được hiển thị trí của nhiệt độ sinh lý được chỉ ra trên hình T ít hơn so với trình tự S2. chuyển pha kết cụm đối với S4 luôn được tìm thấy ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với nhiệt độ chuyển pha của chuỗi đơn. Điều đó hoàn toàn khác khi so sánh với S2, nhiệt độ chuyển pha của nó luôn cao hơn nhiệt độ cuốn của chuỗi đơn. Trong hình 5.4 đồ thị giá trị cực đại nhiệt dung riêng phân tử C peak /M và nhiệt độ tương ứng với cực các cực đại đó T peak được biễu diễn cho tất cả các trình tự đối với số chuỗi xem xét khác nhau M được mô tả trên hình.5. Đồ thị cho thấy sự hiến đổi của cả C peak /M và T peak tăng theo M. Chú ý rằng đối với M =, đỉnh cao nhất của nhiệt dung riêng thuộc về trình tự S2 và S11 mà dạng kết cụm của nó có dạng sợi (hình 5.1). Cũng với hai trình tự này C peak /M tăng theo M nhanh hơn các trình tự khác. Bởi vậy, khả năng tạo thành kết cụm dạng sợi có thể liên quan đến tính hợp tác của chuyển pha kết cụm. Sự biến đổi lớn trong nhiệt độ chuyển pha T peak cho nhiều hệ với trình tự chuỗi khác nhau đưa ra gợi ý một khía cạnh thú vị của sự kết hợp. Giả sử chúng ta xem xét các hệ thống peptide ở nhiệt độ độ sinh lí kí hiệu T. Trong mô hình của chúng tôi T được ước lượng cỡ, 2ɛ/k B, nó liên quan đến năng lượng của liên kết hydro cỡ 5k B T với T là nhiệt độ phòng. Đối với M = 1, chúng tôi tìm thấy tất cả các trình tự trừ S có T peak < T đưa ra gợi ý rằng các peptide thực chất không cấu trúc tại T khi chỉ có một chuỗi đơn. Đối với M = 6 và M = chỉ có ba trình tự S3, S4 và S5 có T peak < T trong khi các trình tự khác có T peak > T. Bởi vậy tại nhiệt độ T các trình tự này không kết cụm trong khi các trình tự khác có khả năng kết cụm. Kết quả này cho thấy rằng sự biến đổi của nhiệt độ chuyển pha kết cụm trong số các trình tự cũng là nguyên nhân giải thích tại sao các trình tự protein cư xử hướng tới kết cụm khác nhau tại nhiệt độ sinh lý. Một 22

25 vài trình tự không kết cụm bởi vì nhiệt động lực học của kết cụm tại nhiệt độ sinh lý không phù hợp cho kết cụm. Chú ý rằng khả năng tạo lập kết cụm dạng sợi không nhất thiết liên quan đến nhiệt độ chuyển pha cao. Thực tế, hình 5.4b chỉ ra rằng các trình tự S2 và S11 chỉ có giá trị nhiệt độ chuyển pha T peak trung bình trong số tất cả các trình tự đối với hệ M = 6 và M =. Một vài trình tự có nhiệt độ T peak cao hơn như S, S9, S tạo lập kết cụm không trật tự. (a) (b) C peak /M (units of k B ) T peak (units of ε/k B ) M= M=6 M=1 T* sequence # E (units of ε) S2, M=4-15 T= MC steps (x 6 ) Hình 5.4: Sự phụ thuộc giá trị cực đại của nhiệt dung Hình 5.5: Đồ thị biểu diễn năng lượng của hệ phụ thuộc riêng trên một phân tử C max (a) và nhiệt độ tương ứng vào số bước MC tại nhiệt độ T=.2. Cấu hình chỉ ra là T max (b) vào trình tự chuỗi đối với hệ M =, M = 6 trạng thái cân bằng không bền với 3 peptid tạo thành và M = 1. Đường nằm ngang trong (b) tương ứng với phiến bê ta có cấu trúc dạng amyloid trong tiếp xúc với nhiệt độ sinh lý giả định trong mô hình T. xoắn mất trật tự tạo bởi peptide thứ 4. Đối với hệ S2, hình 5.2 cho thấy với hệ có M 4 nhiệt độ chuyển pha thấp hơn T =, 2ɛ/k B, điều đó có nghĩa rằng những hệ đó không kết cụm tại nhiệt độ T. Với M > 4 nhiệt độ chuyển pha cao hơn T báo hiệu rằng kết cụm dạng sợi tạo thành bởi trình tự thì ổn định tại nhiệt độ T. Bởi vậy, số peptide cần thiết phải thỏa mãn một điều kiện nhất định để kết cụm xảy ra tại một nhiệt độ đã cho. Chúng tôi tìm thấy đỉnh thấp hơn trong trường hợp hệ M = 4 ( hình 5.2) liên quan đến chuyển pha từ trạng thái kết cụm giả cân bằng tại nhiệt độ trung gian tới trạng thái cơ bản tại nhiệt độ thấp hơn. Hình 5.5 chỉ ra quỹ đạo năng lượng của một mô phỏng cân bằng tại nhiệt độ T =, 2ɛ/k B cho trình tự S2 với M = 4. Sự phụ thuộc năng lượng của hệ vào thời gian trong quỹ đạo cho thấy peptide không kết cụm trong hầu hết thời gian, bởi vậy năng lượng của nó tương đối cao nhưng trong một thời gian ngắn chúng có thấy tạo lập tự phát các kết cụm giải cân bằng có năng lượng thấp. Kết cụm giả cân bằng này có ba sợi-β ( hình 5.5,bên dưới) và có thể đóng vai trò như cấu trúc mẫu cho quá trình sợi 23

26 phát triển trong hệ đối với hệ nhiều peptide hơn. Hình 5.3 chỉ ra sự phụ thuộc chuyển pha nhiệt động phụ thuộc số chuỗi M của hệ có trình tự chuỗi S4. Chú ý rằng tất cả chuyển pha kết cụm cho M > 1 xảy ra tại nhiệt độ thấp hơn so vơi chuyển pha cuốn đối với M = 1, minh họa được chỉ ra ở hình 5.4. Nhiệt độ chuyển pha kết cụm T max tăng khi số chuỗi của hệ M tăng, tuy nhiên, chúng không bao giờ tiến đến nhiệt độ sinh lý T như được chỉ ra ở hình 5.3. Không có sự chuyển từ cấu trúc xoắn thành cấu trúc phiến-β trong cấu trúc kết cụm khi tăng giá trị của M đưa gợi ý rằng chuỗi có trình tự S4 có khả năng rất thấp để tạo thành cấu trúc amyloid 5.3 Động học của quá trình hình thành sợi Chúng tôi xem xét hệ M = peptide với nồng độ c = 1mM dưới điều kiện cân bằng. Hình 5.6 chỉ ra sự phụ thuộc năng lượng toàn phần của hệ vào kích thước kết cụm lớn nhất m tại ba nhiệt độ thấp hơn một chút nhiệt độ chuyển pha T peak. Đồ thị cho thấy trong tất cả các trường hợp nhiệt độ khác nhau này năng lượng tự do có cực tại tại m = 3, gợi ý rằng m = 3 có thể là kích thước tới hạn của sự tạo thành sợi. Hàng rào năng lượng tự do đối với kết cụm chỉ ra là tăng theo T và cỡ từ 1kT tới 4kT. Rào thế này không lớn và thống nhất với sự thật rằng trình tự xem xét có khả năng kết cụm cao. Đối với m > 3, hình 5.6 chỉ ra năng lượng tự do giảm gần như tuyến tính với n, điều đó đồng nghĩa với sự thật rằng sự phát triển của kích thước kết cụm thật sự chỉ theo một chiều. Tiếp theo, chúng tôi xem xét hệ lớn M = 2 peptide và nghiên cứu sự tiến hóa theo thời gian của hệ từ cấu hình ngẫu nhiên phân tán của các monomer. Hơn quỹ đạo độc lập đã được mô phỏng để xác định sự thống kê. Đầu tiên chúng tôi nghiên cứu hệ tại nồng độ c = 1mM và tại nhiệt độ T =, 2ɛ/k B. Hình 5.7(a và b) mô tả ba quỹ đạo năng lượng toàn phần điển hình của hệ và kích thước của kết cụm lớn nhất m như một hàm của thời gian. Những quỹ đạo này chỉ ra một cách rõ ràng bằng chứng về pha trễ ở thời điểm ban đầu, trong suốt thời gian ban đầu đó m thăng giáng nhưng vẫn có giá trị nhỏ ( m < 3) sau đó đến giai đoạn tăng trưởng nhanh và gần như tuyến tính ( Hình 5.7.b). Chúng cũng cho thấy tạo nhân hoàn toàn xảy ra tại m = 3. Hình 5.7.d mô tả một cấu hình peptide tại thời điểm tạo nhân, hình cho thấy các nhân có khả năng tạo thành là một dãy ba phiến-β tạo bởi ba peptide (hình 5.7.e). Hình 5.7c thể hiện rõ rằng hệ có thể tạo lập nhiều kết cụm với kích thước khác nhau. Phân bố của kích thước kết cụm thu được sau thời gian dài có hai vùng phản ánh sự thực là kích thước hệ là hữu hạn và các cụm nhỏ hơn 4 peptide không ổn định. Tiếp theo, chúng ta cũng quan sát thấy một kết cụm với kích thước gần kích thước của hệ hoặc nhiều 24

27 1 S2, M= F (units of ε) m* -5-6 T=.2 T=.21-7 T= m Hình 5.6: Sự phụ thuộc năng lượng tự do F vào kích thước kết cụm lớn nhất m đối với hệ S2 với số chuỗi peptide M = tại ba nhiệt độ khác nhau, T =.2,.21 và.22 ɛ/k B. Trên hình chỉ các rào thế có cực đại tại vị trí m = 3. kết cụm nhỏ hơn. Hình 5.7.f chỉ ra kết cụm lớn nhất ứng với m = 2 peptide có cấu trúc tạo thành một phiến-β kép dài dài tương tự với cấu trúc β chéo. Hình.5. a và b chỉ ra sự phụ thuộc số peptide trung bình n β trong phiến β vào thời gian tại T =, 2ɛ/k B có thể được làm khớp với hàm hồi phục có dạng M(1 e t/t ), ở đây t là thời gian phân loại của kết cụm. Thời gian này phụ thuộc mạnh vào nồng độ c, khi c thay đổi từ 1mM đến, 5mM thì nó thay đổi lớn hơn 3 lần. Trong đồ thị dường như không tồn tại chứng cứ của pha trễ (lag phase) tại T =, 2 ɛ/k B bởi n β tăng tuyến tính theo t tại thời gian t nhỏ ( hình.5.b). Sự thiếu vắng của chứng cứ này có thể liên quan đến độ lệch từ sự phát triển của hàm mũ quá nhỏ để quan sát được. Thật vậy chúng tôi thấy nếu tăng nhiệt độ một lượng nhỏ lên T =, 21 ɛ/k B có thể quan sát được pha trễ. Hình.5.c chỉ ra sự phát triển n β theo thời gian có sự lệch khỏi hàm hồi phục dạng mũ tại thời gian nhỏ. Sự phát triển này nếu được vẽ trên thang log-log chỉ ra rằng tại thời gian nhỏ n β t α với α 1, 25 hàm mũ α > 1 có nghĩa là sự phụ thuộc của n β có dạng đường com lõm. Đó là dấu hiệu chứng tỏ sự tồn tại pha trễ tại thời gian nhỏ. Chứng cứ ủng hộ mạnh mẽ cho sự tồn tại pha trễ tại T =, 21 ɛ/k B khi so sánh với T =, 2 ɛ/k B thì phù hợp với độ cao rào thế đối với tạo nhân tại nhiệt độ tại nhiệt độ tạo lập chỉ ra trước ở hình

28 (a) E (units of ε) (d) T=.2 1 mm 5 15 t ( 6 MC steps) (b) m T=.2 1 mm nucleation 5 15 t ( 6 MC steps) (e) (c) number of aggregates (f) T=.2 t= mm aggregate size Hình 5.7: Động học quá trình kết cụm đối với hệ có trình tự S2 với kích thước hệ M = 2 peptide tại nồng độ 1 mm và nhiệt độ T =.2ɛ/k B. (a) Sự phụ thuộc năng lượng E vào thời gian t được đo theo số bước MC (b) Sự phụ thuộc kích thước kết cụm lớn nhất m đối với ba quỹ đạo được chỉ ra trong phần (a). Các mũi tên trong mỗi quỹ đạo chỉ ra thời điểm tạo nhân. (c) Histogram kích thước kết cụm thu được từ số peptide thu được sau thời gian mô phỏng dài t = bước MC. (d) Hình ảnh chụp lại cấu hình peptide tại thời điểm tạo nhân. (e) Cấu hình của cụm tạo nhân tạo thành bởi ba peptide thu được từ cấu hình chỉ ra trong hình (d). (f) Cấu hình cấu trúc sợi có dạng duỗi dài thu được từ 2 peptide. 5.4 Sự kết tụ của hệ peptide hỗn hợp Cuối cùng, chúng tôi nghiên cứu sự kết cụm đối với hỗn hợp đồng thời của chuỗi S2 và S4. Khi đứng độc lập, nó đã được chỉ ra bằng mô phỏng rằng chuỗi S2 có khả năng rất cao trong việc hình thành cấu trúc sợi còn chuỗi S4 không có khả năng kết cụm để hình thành các cấu trúc phiến-β. Hơn nữa trình tự S4 có nhiệt độ chuyển pha kết cụm nhỏ hơn T, bởi vậy kết cụm không ổn định tại nhiệt độ T. Bằng cách sử dụng một hệ gồm chuỗi có trình tự S2 và chuỗi có trình tự S4 chúng tôi thực hiện mô phỏng để tìm hiểu sự tạo thành amyloid. Đáng chú ý, các mô phỏng của chúng tôi cho thấy trong sự pha trộn cân bằng chuỗi của mỗi trình tự, sau một thời gian, các chuỗi S4 kết cụm và chuyển thành cấu hình phiến-β như quan sát thấy trong nghiên cứu kết cụm của các chuỗi S2 (hình 5.9). Mặc dù phần trăm sợi S4 chuyển thành kết cụm amyloid chỉ cỡ % trên trung bình, những quan sát này là một điển hình về cơ chế kết cụm trên cơ sở bản mẫu (template-based aggregation) và là bằng chứng mô phỏng hỗ trợ mạnh cho giả thiết prion. Nó cho thấy các sợi amyloid có thể được tạo thành từ rất nhiều trình tự chuỗi protein khác nhau và sự hình thành đó của các loại giống sợi đóng một vai trò chính như hoạt động của nó như cấu trúc mẫu để các chuỗi không ưa duỗi dài có thể kết cụm thành sợi. Chú ý rằng liên quan đến sự 26

29 không phù hợp của phần kị nước trong hai trình tự, dạng kết cụm tạo thành bởi hai trình tự bất ổn định hơn so với hệ đồng nhất chỉ có một trình tự (hình 5.9.b). Đồ thị 5.9.c cũng chỉ ra sự phát triển kết cụm của hỗn hợp tại nhiệt độ đã cho giữ nguyên dạng mũ nhưng thời gian phân loại cho kết cụm lớn hơn khi so sánh với hệ đồnh nhất chỉ có trình tự S2. (a) (b) (a) 2 15 <n β > T=.2 1 mm.5 mm (b) <n β > mm 5 15 t ( 6 MC steps) T=.2 1 mm.5 mm.25 mm t ( 6 MC steps) (c) 2 <n β > 15 5 T=.21 1 mm.5 mm 2 3 t ( 6 MC steps) (d) <n β > 1 T=.21 1 mm.5 mm t ( 6 MC steps) Hình 5.: Số peptide trung bình n β trong cấu hình phiến β phụ thuộc vào thời gian đối với kết cụm của hệ M = 2 có trình tự chuỗi S2 tại nhiệt độ T =.2ɛ/k B (a,b) và.21ɛ/k B (c,d) tại nồng độ khác nhau c = 1 mm,.5 mm và.25 mm. Hình bên phải (b và d) giống như (a và c) nhưng trong thang log-log. Các điểm dữ liệu được làm khớp với hàm hồi phục M(1 e t/t ) đối với c = 1 mm (solid) với t = 57 6 cho c = 1 mm in (a) và t = 15 6 cho c =.5 mm trong (a), và t = 9 for c = 1 mm trong (c). Hình vẽ thang log-log chỉ ra rằng sự phát triển của n β tại thời gian ngắn ban đầu theo quy luật dạng mũ, n β t α, với α = 1 trong (b) và α = 1.25 trong (d) cho cả hai nồng độ 1 mm và.5 mm. (c) <n β > total sequence S t (x 6 MC steps) Hình 5.9: (a) Cấu hình thu được trong mô phỏng đối với hệ hỗn hợp chuỗi có trình tự S2 và chuỗi có trình tự S4 tại nồng độ c = 1 mm và nhiệt độ T =.2ɛ/k B. (b)hình ảnh phóng to đối với kết cụm trong hình a. Chú ý rằng sáu chuỗi S4 có mặt trong kết cụm và 5 trong số chúng tồn tại ở trong cấu hình phiếnβ. (c) Số peptide trung bình trong cấu hình phiến β, n β phụ thuộc vào thời gian đối với cả hai trình tự (hình vuông) và chỉ đối với trình tự S4 (hình tròn). Dữ liệu được làm khớp với hàm có t = 32 6 (đường liền nét) đối với trường hợp hai trình tự 5.5 Thảo luận Những nghiên cứu trước đây đối với mô hình ống các kiểu mẫu (pattern) HPPH và HPPPH được xác định có xu hướng tạo thành cấu trúc dạng α trong khi kiểu mẫu HPH có xu hướng tạo thành cấu trúc dạng βtrong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng những quy tắc lựa chon đơn giản vẫn còn đúng cho các peptide trong kết cụm, mặc dù mô hình đã được thay đổi bằng cách xem xét định hướng của các chuỗi bên. Các nghiên cứu hiện tại cho thấy rằng mô hình hỗn hợp hai trình tự cũng xác định tính trật tự của kết cụm. Đặc biệt, cần có sự tương 27

30 thích giữa sự liên kết của các chuỗi bên kị nước và sự đối xứng chung của kết cụm. Điều thú vị là các kiểu mẫu HPH dường như vừa mạnh cho sự tạo thành β và trình tự dễ kết cụm. Phát hiện của chúng tôi là phù hợp với thí nghiệm thiết kế amyloid trước đó, trong đó cho thấy các phân đoạn liên tiếp kị nước phân cực (chẳng hạn như PHPHPHP) có thể hướng các trình tự protein để hình thành những sợi dạng giống amyloid. Điều này đã được báo cáo trong một nghiên cứu gần đây về sự hình thành sợi bằng cách sử dụng mô hình mạng. Thú vị, trong các protein tự nhiên người ta cũng thấy rằng thiên nhiên không ưa kiểu mẫu này. Vai trò quan trọng của các chuỗi bên trong sự hình thành amyloid đã được nhấn mạnh trong các mô phỏng tất cả các nguyên tử. Trong mô hình ống mà không xem xét các định hướng chuỗi bên, cũng có thể thu được kết cụm dạng amyloid. Tuy nhiên, những kết cụm này đôi khi bị mất trật tự trong việc sắp xếp các phiến β. Ở đây, nó cho thấy rằng với tương tác các định hướng chuỗi bên giữa các phiến β có thể trực tiếp dẫn tới các cấu trúc có trật tự cao. Điều này đã được chỉ ra cho các chuỗi với kiểu mẫu (pattern) tuân tự phân cực kị nước xen kẽ có các chuỗi bên kị nước được định hướng ở một bên của phiến β. Định hướng chuỗi bên đã được xem xét trong mô hình mạng dẫn tới một kết quả tương tự như trong nghiên cứu hiện tại của chúng tôi. Lưu ý rằng các tính năng khác của chuỗi bên, chẳng hạn như kích thước, hình dạng và các đặc trưng khác, sẽ đóng vai trò như một mức tăng chi tiết. Ví dụ, thể tích loại trừ của chuỗi bên đã được chỉ ra là tăng cường sự hình thành của xoắn và tấm phẳng, cũng có thể được áp dụng tốt cho các trường hợp amyloid. Thế năng tiếp xúc kị nước với các định hướng chuỗi bên đưa ra trong nghiên cứu này có thể được coi như là một xấp xỉ bậc một cho sự tính toán bất đẳng hướng của tương tác gây ra bởi các chuỗi bên. Kết quả nhiệt động học của chúng tôi cho thấy việc hình thành kết cụm dạng sợi là rất hợp tác chỉ ra bởi chiều cao của đỉnh nhiệt dung riêng. Tính hợp tác cao này có thể được hiểu là do cấu trúc sợi amyloid có tính trật tự cao và sự đóng góp chiếm ưu thế của các tương tác liên phân tử trong các cấu trúc này bao gồm liên kết hydro và tương tác kị nước. Chúng tôi cũng thấy rằng sự ổn định nhiệt động lực học không phải là đặc điểm nổi bật của kết cụm dạng sợi. Đặc biệt, các trình tự có nhiệt độ chuyển pha cao không nhất thiết tạo thành các kệt cụm dạng sợi. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy kiểu mẫu HP là một yếu tố quyết định của cả loại kết cụm amyloid và sự ổn định nhiệt động lực học của nó, chứ không phải bởi tất cả tính kị nước của trình tự. Kết quả của chúng tôi về động học của sự hình thành sợi đã cho thấy sự phù hợp với hiểu biết hiện tại về cơ chế hình thành amyloid trong quá trình tạo mầm và sự phát triển dựa trên cấu trúc mẫu, mặc dù chúng có thể bị giới hạn về kích cỡ hệ thống. Điều thú vị cần lưu ý là hành xử động học không cân bằng của một 2