DOI: 10.37489/0235-2990-2020-65-3-4-7-11 Ñîâìåñòíîå âîçäåéñòâèå áàêòåðèîôàãîâ è àíòèáèîòèêà íà áèîïë íêó Pseudomonas aeruginosa *А. С. ГОРШКОВА 1, В. В. ДРЮККЕР 1, Н. Н. СЫКИЛИНДА 2 1 Лимнологический институт СО РАН, Иркутск 2 Институт биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва The Combined Effect of Bacteriophages and Antibiotics on Pseudomonas aeruginosa Biofilm *A. S. GORSHKOVA 1, V. V. DRUСKER 1, N. N. SYKILINDA 2 1 Limnological Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Irkutsk 2 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow  íàñòîÿùåå âðåìÿ ïî-ïðåæíåìó îñòðî ñòîèò ïðîáëåìà íîçîêîìèàëüíûõ èíôåêöèé. Îäíèì èç êëþ åâûõ âîçáóäèòåëåé òàêîãî ðîäà çàáîëåâàíèé ÿâëÿåòñÿ Pseudomonas aeruginosa. Ïåðñïåêòèâíîñòü èñïîëüçîâàíèÿ áàêòåðèîôàãîâ â ïðîôèëàêòèêå è áîðüáå ñ èíôåêöèîííûìè çàáîëåâàíèÿìè ñåé àñ àêòèâíî èçó àåòñÿ. Öåëüþ èññëåäîâàíèÿ áûëî èçó- åíèå âîçäåéñòâèÿ íîâûõ áàêòåðèîôàãîâ íà áèîïë íêó Pseudomonas aeruginosa ïðè ñîâìåñòíîì èñïîëüçîâàíèè ñ àíòèáèîòèêîì ãåíòàìèöèíîì. Êëåòêè ëàáîðàòîðíîãî ýòàëîííîãî øòàììà P.aeruginosa ÐÀÎ1 âûðàùèâàëè â 96-ëóíî íûõ ïëàíøåòàõ â òå åíèå ñóòîê, îáðàçîâàâøèåñÿ áèîïë íêè îáðàáàòûâàëè àíòèáèîòèêîì ãåíòàìèöèíîì â ðàçëè íûõ êîíöåíòðàöèÿõ, à òàêæå áàêòåðèîôàãàìè AN14 è AN1. Ñòåïåíü äåãðàäàöèè áèîïë íêè îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ îêðàøèâàíèÿ êðèñòàëëè åñêèì ôèîëåòîâûì. Èñïîëüçîâàííûå íîâûå ëèòè åñêèå áàêòåðèîôàãè AN14 (ñåìåéñòâî Siphoviridae), AN1 (ñåìåéñòâî Myoviridae) ïðîäåìîíñòðèðîâàëè âûðàæåííóþ àíòèáèîïë íî íóþ àêòèâíîñòü â ïåðâûå ñóòêè âîçäåéñòâèÿ íà áèîïë íêó P.aeruginosa (p<0,001). Ýôôåêò ðàçðóøèòåëüíîãî âîçäåéñòâèÿ ãåíòàìèöèíà íà áèîïë íêó âîçðàñòàë ñ ðîñòîì êîíöåíòðàöèè àíòèáèîòèêà â äèàïàçîíå 2 16 ìêã/ìë. Äîáàâëåíèå ëèòè åñêèõ áàêòåðèîôàãîâ AN14 è AN1 óñèëèâàëî äåéñòâèå àíòèáèîòèêà (p=0,05). Òàêèì îáðàçîì, ñîâìåñòíîå èñïîëüçîâàíèå ëèòè åñêèõ áàêòåðèîôàãîâ è àíòèáèîòèêîâ ïðèâîäèëî ê áîëåå ýôôåêòèâíîé ýðàäèêàöèè áèîïë íêè, åì êàæäûì àíòèáàêòåðèàëüíûì àãåíòîì îòäåëüíî. Êëþ åâûå ñëîâà: áàêòåðèîôàãè, Pseudomonas aeruginosa, àíòèáèîòèêè, áèîïëåíêè. Currently, the problem of nosocomial infections is of urgent concern. Pseudomonas aeruginosa is one of the key causative agents of this type of disease. The prospect of using bacteriophages in the prevention and control of infectious diseases is now being actively studied. The aim of the work is to study the effect of new bacteriophages on P.aeruginosa biofilm when used together with the antibiotic gentamicin. Cells of the laboratory reference strain P.aeruginosa PAO1 were grown in 96-well plates for a day, the resulting biofilms were treated with gentamicin in various concentrations, as well as bacteriophages AN14 and AN1. The degree of biofilm degradation was evaluated by staining the cells with crystal violet dye. The new lytic bacteriophages AN14 (Siphoviridae family), AN1 (Myoviridae family) used in the study, showed pronounced antibiofilm activity on the first day of exposure to P.aeruginosa biofilm (p<0.001). The destructive effect of gentamicin on biofilms increased when the concentration of the antibiotic was increased in the range of 2 16 mg/ml. Addition of lytic bacteriophages AN14 and AN1 enhanced the effect of the antibiotic (p=0.05). Thus, the combined use of lytic bacteriophages and antibiotics led to a more effective eradication of biofilms than when used separately. Keywords: bacteriophages, Pseudomonas aeruginosa, antibiotics, biofilms. Ââåäåíèå Øèðîêî èçâåñòíûé ôàêò, òî áàêòåðèè Pseudomonas aeruginosa ÿâëÿþòñÿ ïðè èíîé îïïîðòóíèñòè åñêèõ èíôåêöèé è ó àñòâóåò â ðàçâèòèè èíôåêöèîííûõ îñëîæíåíèé â îòäåëåíèÿõ ðåàíèìàöèè è èíòåíñèâíîé òåðàïèè, äîìèíèðóÿ â Êîëëåêòèâ àâòîðîâ, 2020 *Àäðåñ äëÿ êîððåñïîíäåíöèè: å-mail: kovadlo@yandex.ru ýòèîëîãèè íîçîêîìèàëüíîé ïíåâìîíèè, ñâÿçàííîé, â îñíîâíîì, ñ èñêóññòâåííîé âåíòèëÿöèåé ë ãêèõ è ïíåâìîíèè ïðè ìóêîâèñöèäîçå [1].  ïîñëåäíåå âðåìÿ âîçðàñòàåò èíòåðåñ ê âèðóñàì áàêòåðèé áàêòåðèîôàãàì, è ïðîâåä í øèðîêèé ðÿä íåçàâèñèìûõ èññëåäîâàíèé â ðàçëè íûõ ëàáîðàòîðèÿõ ìèðà, ïîñâÿù ííûõ âçàèìîäåéñòâèþ áàêòåðèîôàãîâ è áàêòåðèé. Ïîëó åííûå íàáëþäåíèÿ äàþò îñíîâàíèÿ ïîëàãàòü, òî ôàãè ïðåäñòàâëÿþò îïðåäåë ííûé èíòåðåñ äëÿ òåðàïèè èíôåêöèîííûõ çàáîëåâàíèé [2 4]. Êðîìå òîãî, АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2020, 65; 3 4 7
êëèíè åñêèå èñïûòàíèÿ íà ëþäÿõ äåìîíñòðèðóþò ïðåâîñõîäíûå ðåçóëüòàòû: ïàöèåíò 15 ëåò ñ ìóêîâèñöèäîçîì ñ èíôåêöèåé Mycobacterium abscessus ëå èëñÿ òð õôàçíûì êîêòåéëåì ôàãîâ ïîñëå äâóñòîðîííåé òðàíñïëàíòàöèè ë ãêèõ. Ïðîèçâîäíûå ëèòè åñêîãî ôàãà, êîòîðûå ýôôåêòèâíî óáèâàëè èíôåêöèîííûé øòàìì M.abscessus, áûëè ðàçðàáîòàíû ñ ïîìîùüþ ãåííîé èíæåíåðèè. Âíóòðèâåííîå ëå åíèå ôàãîì õîðîøî ïåðåíîñèëîñü è àññîöèèðîâàëîñü ñ îáúåêòèâíûì êëèíè åñêèì óëó øåíèåì, âêëþ àÿ çàêðûòèå ñòåðíàëüíîé ðàíû, óëó øåíèå ôóíêöèè ïå åíè è çíà èòåëüíîå óñòðàíåíèå èíôèöèðîâàííûõ óçëîâ êîæè. Àâòîðû íå èñêëþ àëè âåðîÿòíîñòü òîãî, òî óñïåøíîå ëå åíèå ïàöèåíòà ïðîèçîøëî áû è áåç ëå åíèÿ ôàãîì. Òåì íå ìåíåå, â ðàáîòå îòìå àëîñü, òî ïàöèåíòû ñ ïîäîáíûìè êëèíè åñêèìè ñîñòîÿíèÿìè îáû íî èìåþò âûñîêóþ ñìåðòíîñòü, è òî óëó øåíèå íå áûëî ñâÿçàíî ñ ïðåêðàùåíèåì èëè íà àëîì ïðè- ìà äðóãèõ ëåêàðñòâ. Êðîìå òîãî â ïîääåðæêó äîêàçàòåëüñòâà ðîëè áàêòåðèîôàãîâ â âûçäîðîâëåíèè áîëüíîãî ÿâëÿåòñÿ äîêàçàòåëüñòâî ðåïëèêàöèè ôàãà in vivo [5]. Ðàíåå ìû îáíàðóæèëè, òî áàêòåðèîôàãè ïîìîãàþò çíà èòåëüíî ñíèçèòü ìèíèìàëüíóþ èíãèáèðóþùóþ è áàêòåðèöèäíóþ êîíöåíòðàöèè àíòèáèîòèêîâ (ãåíòàìèöèíà è öèïðîôëîêñàöèíà) ó P.aeruginosa [6]. Ýòè íàáëþäåíèÿ áûëè ïðîâåäåíû íà ïëàíêòîííûõ êëåòêàõ, ïîýòîìó íåîáõîäèìî áûëî îïðåäåëèòü, êàêîå âîçäåéñòâèå îêàçûâàþò áàêòåðèîôàãè ñîâìåñòíî ñ àíòèáèîòèêàìè íà êëåòêè, ñóùåñòâóþùèå â âèäå áèîïë íêè. Öåëü ðàáîòû èçó åíèå âëèÿíèÿ ôàãîâ â êîìáèíàöèè ñ àíòèáèîòèêîì íà áèîïë íêó P.aeruginosa. Ìàòåðèàë è ìåòîäû Äëÿ âñåõ ýêñïåðèìåíòîâ èñïîëüçîâàëèñü ýòàëîííûå øòàììû P.aeruginosa PAO1 (èç êîëëåêöèè ïðîô. Â. Í. Êðûëîâà, ÍÈÈÂÑ èì. È. È. Ìå íèêîâà, Ìîñêâà è êîëëåêöèè ëàáîðàòîðèè ãåííûõ òåõíîëîãèé Êàòîëè åñêîãî óíèâåðñèòåòà, ã. Ë âåí, Áåëüãèÿ). Øòàìì AN1 (ñåìåéñòâî Myoviridae) áûë âûäåëåí èç î èñòíûõ ñîîðóæåíèé ã. Èðêóòñêà, AN14 (ñåìåéñòâî Siphovi-ridae) èç ðåêè Ñåëåíãè. Îáà øòàììà èìåëè ïðîçðà íûå çîíû ëèçèñà (ðèñ. 1), òî óêàçûâàåò íà ëèòè åñêèé òèï æèçíåííîãî öèêëà èñïîëüçóåìûõ øòàììîâ è çîíó îðåîëà âîêðóã çîíû ëèçèñà, òî ïðåäïîëîæèòåëüíî ãîâîðèò î íàëè èè àêòèâíîñòè, äåïîëèìåðèçóþùåé âíåêëåòî íûå ïîëèìåðíûå âåùåñòâà P.aeruginosa. Áûë èñïîëüçîâàí àíòèáèîòèê ãåíòàìèöèí (ïðîèçâîäñòâî «Áåëìåäïðåïàðàòû»). Ýêñïåðèìåíò ïî âîçäåéñòâèþ ôàãîâ íà áèîïë íêè áûë ïðîâåä í ñîãëàñíî îáùåïðèíÿòîé ìåòîäèêå ñ èñïîëüçîâàíèåì ìèêðîòèòðîâàëüíûõ ïëàíøåòîâ [7]. Áèîïë íêè âûðàùèâàëè â òå åíèå 24 â 96-ëóíî íûõ ïëàíøåòàõ ïðè 37 Ñ. Â êà åñòâå ïèòàòåëüíîé ñðåäû èñïîëüçîâàëè LB: òðèïòîí 1%, äðîææåâîé ýêñòðàêò 0,5%, NaCl 1%. Ïîñëå êóëüòèâèðîâàíèÿ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó îòáèðàëè è ëóíêè ïðîìûâàëè ôèçèîëîãè åñêèì ðàñòâîðîì äëÿ óäàëåíèÿ íåïðèêðåïë ííûõ êëåòîê. Çàòåì ê áèîïë íêàì äîáàâëÿëè ðàçëè íûå âàðèàíòû: ãåíòàìèöèí â ðàçëè íûõ êîíöåíòðàöèÿõ (2, 4, 8, 16 ìêã/ìë), áàêòåðèîôàãè AN1, AN14 â êîëè åñòâå 10 7 ÁÎÅ íà 1 ëóíêó (áëÿøêî-îáðàçóþùèå åäèíèöû). Ïåðåä ýêñïåðèìåíòîì áàêòåðèàëüíàÿ êóëüòóðà òåñòèðîâàëàñü íà óâñòâèòåëüíîñòü ê áàêòåðèîôàãàì ìåòîäîì äâóõñëîéíîãî àãàðà, à ôàãîâàÿ ñóñïåíçèÿ ïðîâåðÿëàñü íà áàêòåðèàëüíóþ ñòåðèëüíîñòü ïîñåâîì íà ñðåäó LB. Ýêñïåðèìåíòû áûëè ïðîâåäåíû â 3 5-êðàòíûõ ïîâòîðíîñòÿõ. Â êà- åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ âûñòóïàëè êëåòêè P.aeruginosa â ñðåäå LB, â êà åñòâå îòðèöàòåëüíîãî êîíòðîëÿ ñðåäà LB áåç êëåòîê. Êóëüòèâèðîâàíèå áèîïë íîê ñ ôàãàìè, ãåíòàìèöèíîì è èõ êîìáèíàöèåé ïðîâîäèëè â òåðìîñòàòå ïðè 37 Ñ â òå åíèå 20 24. Çàòåì ïèòàòåëüíóþ ñðåäó è ïëàíêòîííûå êëåòêè îòáèðàëè è ëóíêè ïðîìûâàëè ôèçèîëîãè åñêèì ðàñòâîðîì, ñóøèëè è îêðàøèâàëè 0,4% âîäíûì ðàñòâîðîì êðèñòàëëè åñêîãî ôèîëåòîâîãî. Ïîñëå 15-ìèíóòíîãî îêðàøèâàíèÿ ïëàíøåòû ïðîìûâàëè òàê, òî â ëóíêàõ ñ îòðèöàòåëüíûì êîíòðîëåì íå îñòàâàëîñü íåñïåöèôè åñêè ñâÿçàâøåãîñÿ êðàñèòåëÿ. Ïîñëå ïðîñóøèâàíèÿ â êàæäóþ ëóíêó äîáàâëÿëè 96% ýòàíîë è îñòàâëÿëè ýêñòðàãèðîâàòüñÿ â òå åíèå 20 ìèí. Ïîñëå îïòè åñêóþ ïëîòíîñòü ðàñòâîðà èçìåðÿëè íà ôîòîýëåêòðîêîëîðèìåòðå ïðè äëèíå âîëíû 590 íì. Ìèíèìàëüíóþ èíãèáèðóþùóþ è ìèíèìàëüíóþ áàêòåðèöèäíóþ êîíöåíòðàöèè îïðåäåëÿëè ñîãëàñíî Ìåòîäè åñêèì óêàçàíèÿì 4.2.1890-04. Ñòàòèñòè åñêóþ çíà èìîñòü ðàçëè èé ìåæäó äàííûìè îïòè åñêîé ïëîòíîñòè êðèñòàëëè åñêîãî ôèîëåòîâîãî êîíòðîëüíûõ áèîïë íîê è îáðàáîòàííûõ ôàãàìè îöåíèâàëè t-êðèòåðèåì Ñòüþäåíòà. Íåïàðàìåòðè èñêèé êðèòåðèé Ìàííà Óèòíè ïðèìåíÿëè äëÿ îöåíêè ðàçëè èé ìåæäó áèîïë íêàìè ñ àíòèáèîòèêàìè ðàçëè íûõ êîíöåíòðàöèé è èìè æå ñ äîáàâëåíèåì áàêòåðèîôàãîâ. Ðåçóëüòàòû èññëåäîâàíèÿ Áàêòåðèîôàã AN14 îïðåäåë í êàê ïðåäñòàâèòåëü ðîäà Yuavirus, ñåìåéñòâî Siphoviridae, ïîðÿäîê Caudovirales (ðèñ. 2, à). Åãî ãåíîì (¹ KX198613.1 â GenBank), òàêæå êàê è ãåíîìû äðóãèõ ïðåäñòàâèòåëåé ýòîãî ðîäà, ñîäåðæèò ãåí èíòåãðàçû. Îäíàêî äëÿ ýòèõ ôàãîâ íå óäàëîñü ïîëó èòü ëèçîãåííûå øòàììû [8], è èõ ãåíîì íå îáíàðóæèâàåòñÿ â ñîñòàâå áàêòåðèàëüíîãî ãåíîìà P.aeruginosa â êà åñòâå ïðîôàãà. Ïîýòîìó ôàãè ýòîãî ðîäà îòíîñÿò ê ëèòè åñêèì. Áàêòåðèîôàã AN1 îòíîñèòñÿ ê ãèãàíòñêèì ôàãàì P.aeruginosa ðîäó ϕkz (ðèñ. 2, á). Ïåðåä ïðîâåäåíèåì ýêñïåðèìåíòà ïî âîçäåéñòâèþ ôàãîâ è àíòèáèîòèêîâ íà áèîïë íêó ìû óáåäèëèñü, òî èñïîëüçóåìûé øòàìì îáðà- Рис. 1. Зоны лизиса фагов AN14, AN1 через 5 сут роста. Отдельные бляшки могут достигать 6 мм за счёт зоны ореола. 8 АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2020, 65; 3 4
a Рис. 2. Трансмиссионная электронная микроскопия (шкала 100 нм). а штамм AN14; б штамм AN1. Рис. 3. Эпифлуоресцентная микроскопия биоплёнки Pseudomonas aeruginosa PAO1 на покровных микроскопических стеклах, окраска ДАФИ. Рис. 4. Влияние различных концентраций гентамицина в комбинации с бактериофагами AN1 и AN14 на биоплёнку P.aeruginosa РАО1. Столбики отражают средние результаты и стандартное отклонение измерений количества красителя, специфически связавшегося с биопленкой P.aeruginosa в различных вариациях эксперимента. б çóåò áèîïë íêè â òå åíèå 24. Íà ðèñ. 3 ïîêàçàíà êóëüòóðà Pseudomonas aeruginosa PAO1 íà ñòåêëå ïîñëå êóëüòèâèðîâàíèÿ â òå åíèå 24 ïðè 37 Ñ â æèäêîé ñðåäå LB. Âèäíû òèïè íûå äëÿ áèîïë íîê P.aeruginosa ìèêðîêîëîíèè. Òàêàÿ ñóòî íàÿ áèîïë íêà áûëà îáðàáîòàíà ðàçëè íûìè êîíöåíòðàöèÿìè ãåíòàìèöèíà â ñî åòàíèè ñ áàêòåðèîôàãàìè. Íà ðèñ. 4 ïðåäñòàâëåíû ñðåäíèå ïîêàçàòåëè è ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå òð õ íåçàâèñèìûõ ýêñïåðèìåíòîâ 2 øòàììîâ P.aeruginosa ÐÀÎ1. Èç ðèñ. 4 âèäíî, òî çà ñóòêè èíêóáàöèè áàêòåðèîôàãè AN14 è AN1 çíà èòåëüíî ñîêðàòèëè áèîïë íêó â ñðåäíåì íà 60% (p<0,001). Ýòîò ïîêàçàòåëü ñîïîñòàâèì ñ äàííûìè ïî àíòèáèîïë íî íîé àêòèâíîñòè êîêòåéëÿ èç ôàãîâ ñåìåéñòâ Myoviridae è Podoviridae, ïîëó åííûõ íà íåñêîëüêèõ äåñÿòêàõ øòàììîâ, âûäåëåííûõ ó áîëüíûõ ðèíîñèíóñèòîì [9]. Òàêæå â ðåçóëüòàòå ðàáîòû ñòàëî ÿñíî, òî áàêòåðèîôàãè AN1, AN14 è ãåíòàìèöèí äåãðàäèðóþò áèîïë íêó P.aeruginosa ýôôåêòèâíåå ïðè ñîâìåñòíîì èñïîëüçîâàíèè (p=0,05). Èíòåðåñíî, òî â àíàëîãè íîì èññëåäîâàíèè ñ èñïîëüçîâàíèåì P.aeruginosa PA14 è Pb-ïîäîáíîãî è SN-ïîäîáíîãî áàêòåðèîôàãîâ íå áûëî ïîëó åíî ïîëîæèòåëüíîãî ñîâìåñòíîãî ýôôåêòà c ãåíòàìèöèíîì ïðè âûðàùèâàíèè áèîïë íîê â ïëàñòèêîâûõ ïëàíøåòàõ, íî áûë ïîëîæèòåëüíûé ðåçóëüòàò íà ýïèòåëèàëüíûõ êëåòêàõ [10]. Âîçìîæíî, ýòî ñâÿçàíî ñ òåì, òî âçàèìîäåéñòâèå ðàçëè íûõ øòàììîâ ôàãîâ è áàêòåðèé â çíà èòåëüíîé ñòåïåíè ñïåöèôè íî [11]. Ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòà ïîêàçàëè, òî èñïîëüçóåìûå áàêòåðèîôàãè è àíòèáèîòèê ñïîñîáíû çíà èòåëüíî ñîêðàòèòü áèîïë íêó P.aeruginosa â ñðåäíåì íà 90% ïðè êîíöåíòðàöèè ãåíòàìèöèíà 16 ìêã/ìë. Âàæíî îòìåòèòü, òî åðåç 24 48 ýêñïîçèöèè ñ àíòèáèîòèêîì è âèðóñàìè â êóëüòóðå ïîÿâëÿþòñÿ óñòîé èâûå êëåòêè, êîòîðûå âîññòàíàâëèâàþò èñëåííîñòü áàêòåðèé äî êîíòðîëüíîãî óðîâíÿ. Â ïëàíêòîííîé êóëüòóðå òàêæå êàê è íà áèîïë íêàõ ïî îòäåëüíîñòè ôàãè è àíòèáèîòèêè ïðè îïðåäåë ííîé êîíöåíòðàöèè ñíèæàëè èñëåííîñòü áàêòåðèàëüíîé ïîïóëÿöèè. Ñîâìåñòíîå âîçäåéñòâèå áàêòåðèîôàãîâ è àíòèáèîòèêîâ ïðè òîé æå êîíöåíòðàöèè àíòèáèîòèêà ïðèâîäèëî ê ïîëíîìó АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2020, 65; 3 4 9
Определение минимальной бактерицидной концентрации гентамицина в отношении планктонных клеток P.aeruginosa PAO1 Øòàììû Ñóòêè Ãåíòàìèöèí, ìêã/ìë 0 2 4 8 16 32 64 128 PAO1 1-å + 2-å + + + + 5-å + + + + + PAO1 + áàêòåðèîôàã AN1 1-å 2-å + + 5-å + + + Примечание. «+» визуально определяемый рост по помутнению среды; отсутствие роста, жидкая питательная среда прозрачная. 10 óíè òîæåíèþ áàêòåðèàëüíûõ êëåòîê çà ïðîìåæóòîê âðåìåíè, çà êîòîðûé íå óñïåâàëè ïîÿâëÿòüñÿ ôàãîóñòîé èâûå è àíòèáèîòèêîóñòîé èâûå êëåòêè (òàáëèöà). Ìåòîä, èñïîëüçóåìûé äëÿ îöåíêè äåãðàäàöèè áèîïë íîê, íå ïîçâîëÿåò îöåíèòü êîëè åñòâî îñòàâøèõñÿ æèçíåñïîñîáíûõ êëåòîê, ïîýòîìó îñòà òñÿ íå ÿñíûì ïðè êàêîé êîíöåíòðàöèè àíòèáèîòèêà ïðîèñõîäèò ýðàäèêàöèÿ áèîïë íêè è ïðîèñõîäèò ëè âîîáùå. Òàêæå áûëî îáíàðóæåíî, òî ñ ðîñòîì êîíöåíòðàöèè àíòèáèîòèêà óìåíüøàëñÿ ñóììàðíûé ýôôåêò ñ ôàãîì. Ïîäîáíîå íàáëþäàëîñü è â äðóãèõ ðàáîòàõ: âîñüìèêðàòíàÿ è îäíîêðàòíàÿ êîíöåíòðàöèÿ àíòèáèîòèêà òîáðàìèöèíà ñ ôàãàìè íå îòëè àëèñü ïî ýôôåêòó, òî àâòîðû îáúÿñíèëè òåì, òî ïðè áîëåå âûñîêîé êîíöåíòðàöèè àíòèáèîòèêà ñòàíîâèòñÿ çàòðóäíèòåëüíûì ðàçìíîæåíèå ôàãà [10]. Ìåõàíèçì ñèíåðãåòè åñêîãî ýôôåêòà àíòèáèîòèêîâ è ôàãîâ ïîêà äî êîíöà íå ïîíÿòåí. Îäíàêî ñóùåñòâóþò ïðåäïîëîæåíèÿ, òî â ðåçóëüòàòå âûðàáîòêè ôàãîóñòîé èâîñòè ó êëåòîê îäíîâðåìåííî ñ ýòèì îñëàáëÿåòñÿ óñòîé èâîñòü ê àíòèáèîòèêàì [12]. Íàìè áûëî ïðîâåäåíî îïðåäåëåíèå ÌÈÊ ôàãîóñòîé èâîé êóëüòóðû P.aeruginosa, âûäåëåííîé ïîñëå êóëüòèâèðîâàíèÿ ñ áàêòåðèîôàãîì. Îêàçàëîñü, òî ìèíèìàëüíàÿ èíãèáèðóþùàÿ êîíöåíòðàöèÿ àíòèáèîòèêà áûëà èäåíòè íîé ó óâñòâèòåëüíîãî è íå óâñòâèòåëüíîãî ê ôàãó âàðèàíòà. Åäèíîé õàðàêòåðèñòèêîé äëÿ áîëüøèíñòâà ôàãîâ ÿâëÿåòñÿ ñâîéñòâî ïîÿâëåíèÿ ôàãîóñòîé- èâûõ âàðèàíòîâ, òî ïðèâîäèò ê âîññòàíîâëåíèþ áàêòåðèàëüíîé ïîïóëÿöèè. Ðåøåíèåì ýòîé ïðîáëåìû ñïåöèàëèñòû â ôàãîâîé òåðàïèè ïðåäëàãàþò èñïîëüçîâàíèå ñìåñè èç áàêòåðèîôàãîâ, èñïîëüçóþùèõ ðàçëè íûå ðåöåïòîðû íà ïîâåðõíîñòè êëåòî íîé ñòåíêè. Ýòîò ïîäõîä ïîçâîëÿåò óâåëè èòü âðåìÿ ïîÿâëåíèÿ ôàãîóñòîé èâûõ âàðèàíòîâ. Áîëåå òîãî, ïðåäëàãàåòñÿ èñïîëüçîâàòü ïîñëåäîâàòåëüíî íåñêîëüêî êîêòåéëåé ôàãîâ, òî äà ò åù áîëüøå âðåìåíè äëÿ êîíòðîëÿ íàä ôàãîâîé ïîïóëÿöèåé äëÿ âûðàáîòêè èììóííîãî îòâåòà îðãàíèçìà [13]. Çàêëþ åíèå Îñíîâíûì ðåçóëüòàòîì íàøåãî èññëåäîâàíèÿ ÿâëÿåòñÿ äîêàçàòåëüñòâî ñïîñîáíîñòè íîâûõ áàêòåðèîôàãîâ P.aeruginosa AN1 è AN14 ðàçðóøàòü ñôîðìèðîâàâøóþñÿ áèîïë íêó, à òàêæå èõ ïîëîæèòåëüíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ ñ àíòèáèîòèêîì ãåíòàìèöèíîì â ðàçðóøåíèè áèîïë íêè. Ýòî ãîâîðèò î òîì, òî ïðèìåíåíèå áîëåå íèçêèõ êîíöåíòðàöèé àíòèáèîòèêà ñîâìåñòíî ñ ôàãîì ìîæåò èìåòü òîò æå àíòèáàêòåðèàëüíûé ýôôåêò, òî è âûñîêèå äîçû àíòèáàêòåðèàëüíîãî ïðåïàðàòà, èìåþùåãî òÿæ ëûå ïîáî íûå ýôôåêòû. Ïðîâåä ííûå íàìè èññëåäîâàíèÿ âíîñÿò âêëàä â ñîâìåñòíûå óñèëèÿ ïî èçó åíèþ âëèÿíèÿ áàêòåðèîôàãîâ íà áèîïë íêó áàêòåðèé Pseudomonas aeruginosa. Ïîëó åííûå äàííûå ñ èñïîëüçîâàíèåì íîâûõ áàêòåðèîôàãîâ ðàñøèðÿþò è óãëóáëÿþò ïîíèìàíèå äàííîãî âîïðîñà. Èñòî íèê ôèíàíñèðîâàíèÿ. Ðàáîòà âûïîëíåíà ïî ãîñáþäæåòíîìó ïðîåêòó ÀÀÀÀ-À16-116122110061-6. Áëàãîäàðíîñòè. Âûðàæàåì áëàãîäàðíîñòü ÖÊÏ «Óëüòðàìèêðîàíàëèç» ËÈÍ ÑÎ ÐÀÍ çà ïðåäîñòàâëåíèå òðàíñìèññèîííîãî ýëåêòðîííîãî ìèêðîñêîïà. ЛИТЕРАТУРА 1. Ëàçàðåâà À.Â., åáîòàðü È.Â., Êðûæàíîâñêàÿ Î.À., åáîòàðü Â.È., Ìàÿíñêèé Í.À. Pseudomonas aeruginosa: ïàòîãåííîñòü, ïàòîãåíåç è ïàòîëîãèÿ. Êëèíè åñêàÿ ìèêðîáèîëîãèÿ è àíòèìèêðîáíàÿ õèìèîòåðàïèÿ. 2015. Ò. 17. ¹ 3. Ñ. 170 186. / Lazareva A.V., Chebotar' I.V., Kryzhanovskaya O.A., Chebotar' V.I., Mayanskij N.A. Pseudomonas aeruginosa: patogennost', patogenez i patologiya. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya 2015; 17 (3): 170 186. [in Russian] 2. Waters E.M., Neill D.R., Kaman B., Sahota J.S., Clokie M.R.J., Winstanley C. et. al. Phage therapy is highly effective against chronic lung infections with Pseudomonas aeruginosa. Thorax 2017; 72 (7): 666 667. 3. Danis-Wlodarczyk K., Vandenheuvel D., Jang H. B., Briers Y., Olszak T., Arabski M. et al. A proposed integrated approach for the preclinical evaluation of phage therapy in Pseudomonas infections. Scientific reports 2016; 28115 (6). doi.org/10.1038/srep28115 4. Alves D.R, Perez-Esteban P., Kot W., Bean J. E., Arnot T., Hansen L. H. et al. A novel bacteriophage cocktail reduces and disperses Pseudomonas aeruginosa biofilms under static and flow conditions. Microb Biotechnol 2015; 9 (1): 61 74. 5. Dedrick R. M., Guerrero-Bustamante C.A., Garlena R.A., Russell D.A., Ford K., Harris K., Gilmour K.C., Soothill J., Jacobs-Sera D., Schooley R.T., Hatfull G.F., Spencer H. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nature Medicine 2019; 25: 730 733. 6. Ãîðøêîâà À.Ñ., Ñûêèëèíäà Í.Í., Äðþêêåð Â.Â. Ýôôåêò áàêòåðèîôàãîâ íà ïîâûøåíèå óâñòâèòåëüíîñòè êëåòîê Pseudomonas aeruginosa ê àíòèáèîòèêàì. Ñáîðíèê òåçèñîâ VI Âñåðîññèéñêîãî ñ ìåæäóíàðîäíûì ó àñòèåì Êîíãðåññà ìîëîäûõ ó åíûõ-áèîëîãîâ 'Ñèìáèîç- АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2020, 65; 3 4
Ðîññèÿ 2013', Èðêóòñê. Èçäàòåëüñòâî 'Àñïðèíò', 2013. C. 68 69. / Gorshkova A.S., Sykilinda N.N., Drjyukker V.V. Effekt bakteriofagov na povyshenie chuvstvitel'nosti kletok Pseudomonas aeruginosa k antibiotikam. Sbornik tezisov VI Vserossijskogo s mezhdunarodnym uchastiem Kongressa molodykh uchenykh-biologov 'Simbioz-Rossiya 2013', Irkutsk. Izdatel'stvo 'Asprint', 2013; 68 69. 7. Knezevic P., Petrovic O. A colorimetric microtiter plate method for assessment of phage effect on Pseudomonas aeruginosa biofilm. J Microbiol Methods 2008; 74 (2 3), 114 118. 8. Ceyssens P.J., Mesyanzhinov V., Sykilinda N., Briers Y., Roucourt B., Lavigne R., Robben J., Domashin A., Miroshnikov K., Volckaert G., Hertveldt K. The genome and structural proteome of YuA, a new Pseudomonas aeruginosa phage resembling M6. J Bacteriol 2008; 190 (4): 1429 1435. 9. Fong S.A., Drilling A., Morales S., Cornet M.E., Woodworth B. A., Fokkens W. J. Activity of bacteriophages in removing biofilms of Pseudomonas aeruginosa isolates from chronic rhinosinusitis patients. Front Cell Infect Microbiol 2017; 7 (418). doi:10.3389/fcimb.2017.00418 СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ: Ãîðøêîâà Àííà Ñåðãååâíà ê. á. í., íàó íûé ñîòðóäíèê ëàáîðàòîðèè âîäíîé ìèêðîáèîëîãèè ËÈÍ ÑÎ ÐÀÍ, Èðêóòñê Äðþêêåð Âàëåíòèí Âàëåðüÿíîâè ä. á. í., ãëàâíûé íàó íûé ñîòðóäíèê ëàáîðàòîðèè âîäíîé ìèêðîáèîëîãèè ËÈÍ ÑÎ ÐÀÍ, Èðêóòñê 10. Chaudhry W.N., Concepcio n-acevedo J., Park T., Andleeb S., Bull J.J., Levin B.R. Synergy and Order Effects of Antibiotics and Phages in Killing Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS ONE 2017; 12 (1): e0168615. doi:10.1371/journal.pone.0168615 11. Latz S., Krüttgen A., Häfner H., Buhl E. M., Ritter K., Horz H.P. Differential Effect of Newly Isolated Phages Belonging to PB1-Like, phikz-like and LUZ24-Like Viruses against Multi-Drug Resistant Pseudomonas aeruginosa under Varying Growth Conditions Viruses 2017; 9 (315). doi:10.3390/v9110315 12. Chan B. K., Turner P. E., Kim S., Mojibian H. R., Elefteriades J. A, Narayan D. Phage treatment of an aortic graft infected with Pseudomonas aeruginosa. Evolution, Medicine, and Public Health 2018; 1 (2018): 60 66. doi:10.1039/emph/eoy005 13. Schmidt C. Phage therapy's latest makeover. Nature Biotechnology 2019; https://doi.org/10.1038/s41587-019-0133-z Ñûêèëèíäà Íèíà Íèêîëàåâíà ê. á. í., íàó íûé ñîòðóäíèê ëàáîðàòîðèè ãåííîé èíæåíåðèè Èíñòèòóòà áèîîðãàíè åñêîé õèìèè èì. àêàä. Ì. Ì. Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ- èííèêîâà ÐÀÍ, Ìîñêâà АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2020, 65; 3 4 11