OXFORD AGAR PHÁT HIỆN LISTERIA I. ỨNG DỤNG Oxford agar là môi trường chọn lọc được sử dụng để phân lập và định lượng Listeria monocytogenes từ sữa và phô mai, cũng như trong các mẫu thực phẩm khác. Môi tường truyền thông có thể được sử dụng là môi trường chọn lọc thứ hai trong phương pháp phát hiện của Listeria monocytogenes trong vi sinh vật thực phẩm NF EN ISO 11290-1 II. LỊCH SỬ Môi trường đã được thiết lập bởi Curtis et al. vào năm 1988 để phân lập vi khuẩn Listeria monocytogenes từ các mẫu bệnh phẩm có chứa vi gây nhiễm. Trong hầu hết các trường hợp, tác giả đã quan sát thấy rằng các chủng Listeria xuất hiện trong vòng 24 giờ ủ và vi sinh vật liên quan bị ức chế. Nghiên cứu dựa trên công việc của Rodriguez (1984), là người đầu tiên sử dụng muối esculin và sắt để tìm thấy Listeria monocytogenes bởi đặc tính esculinase (+) của nó. Nhiều môi trường chọn lọc Listeria có chứa esculin, đồng thời cũng cho phép khuẩn cầu ruột phát triển. Curtis và cộng sự cho thấy rằng vi sinh thử cấp bị ức chế bởi lithium clorua, acriflavine, cycloheximide, colistin, cefotetan và fosfomycin. NGUYÊN TẮC Polypeptone giúp cho sự tăng trưởng tối ưu của Listeria. Chiết xuất nấm men là một nguồn vitamin B. Tinh bột là nguồn năng lượng cho sự phát triển của vi sinh vật. NaCl duy trì cân bằng thẩm thấu. Listeria thủy phân esculin thành glucose và esculetin, sau đó các hợp chất này hình thành một phức hợp màu đen với các ion Fe 3+ được cung cấp bởi ferric citrate (C 6 H 5 FeO 7 ).
Vi sinh vật gây nhiễm bị ức chế bởi lithium chloride, cycloheximide, colistin, cefotetan, Fosfomycin và acriflavine. III. THÀNH PHẦN ĐIỂN HÌNH CỦA MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN (có thể được điều chỉnh để có hiệu suất tối ưu) Thành phần trong 1L môi trường: Polypeptone...23.0 g Yeast extract...3.0 g Tinh bột...1.0 g NaCl...5.0 g Esculin... 1.0 g Ferric ammonium citrate... 0.5 g Lithium chloride...15.0 g Cycloheximide...400.0 mg Colistine (sulfate)...20.0 mg Cefotetan...2.0 mg Fosfomycin...10.0 mg Acriflavin...5.0 mg Bacteriological agar...13.0 g ph của môi trường đổ sẵn ở 25 o C: 7.0 ± 0.2 IV. CHUẨN BỊ Cân 58,5 g môi trường bột khô cơ bản (BK110) trong 1 lít nước cất hoặc nước khử ion.
Đun sôi từ từ, vừa đun vừa khuấy đều cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Cho 100 ml vào trong bình 150 ml. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121 C trong 15 phút. Làm nguội và duy trì ở 44-47 o C. - Hóa lỏng supplement BS003 với 5ml ethanol và nước theo tỉ lệ 1:1 Trộn đều hoặc vortex để đảm bảo rằng dung dịch được hòa tan, tránh tạo bọt khí Với 100ml của môi trường cơ bản đem vô trùng, sau đó thêm 1ml dung dịch Oxford Selective Supplement (BS003). Đổ vào đĩa petri đã vô trùng. Chờ đông môi trường. V. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG Làm khô môi trường trong tủ ấm bằng cách mở hé nắp. Từ môi trường tăn sinh chọn lọc, tiến hành cấy ria lên bề mặt môi trường bằng que cấy vòng để phân lập Ủ ở 37 o C trong 24-48 giờ. CHÚ Ý Đối với thực phẩm chỉ bị ô nhiễm nhẹ bởi một hệ thực vật thứ sinh, môi trường có thể được ủ ở 30 C hoặc ở 35 C. VI. KẾT QUẢ Sau 24 giờ ủ, Listeria monocytogenes hình thành các khuẩn lạc có màu xanh ô liu, có vòng đen bao quanh. Sau 48 giờ, chúng trở nên tối màu hơn với tâm đen lõm sâu và được bao quanh bởi quầng đen. Oxford agar là một môi trường có tính chọn lọc cao nhưng đôi khi có thể quan sát được chủng staphylocci hoặc enterococci ( phát triển chậm và cho ra một vùng màu vàng và vàng nhạt, thường xuất hiện sau 30-40 giờ ủ). XEM PHỤ LỤC HÌNH ẢNH VII. KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG Môi trường bột khô: bột màu be, chảy tự do và đồng nhất. Supplement: viên vàng, sau khi pha loãng thành dung dịch huỳnh quang màu vàng. Môi trường pha sẵn: agar màu vàng xanh với ánh xạ hơi xanh.
Kết quả nuôi cấy sau 24 giờ ủ ở 37 o C. vi sinh vật Listeria monocytogenes 4b WDCM 00021 Listeria monocytogenes WDCM 00020 Escherichia coli WDCM 00013 Enterococcus faecalis WDCM 00087 Tăng trưởng (tỷ lệ năng suất P R ) PR 50% PR 50% ức chế, score 0 ức chế, score 0 Đặc điểm Khuẩn lạc màu xanh ô liu bao quanh bởi vùng đen Khuẩn lạc màu xanh ô liu bao quanh bởi vùng đen - - VIII. BẢO QUẢN/ THỜI GIAN SỬ DỤNG Môi trường bột khô cơ bản: 2-30 o C Hạn sử dụng được ghi trên bao bì. Môi trường đã chuẩn bị (giá trị điểm chuẩn) Môi trường cơ bản trong chai: 6 tháng ở 2-8 o C Môi trường đổ đĩa: 1 tháng ở 2-8 o C, tránh ánh sáng. Oxford selective supplement (CCCFA) Lưu trữ trong khoảng 2-8 o C, tránh ánh sáng. Hạn sử dụng được ghi trên chai. IX. ĐÓNG GÓI Môi trường bột khô cơ bản ( với Cycloheximide, Colistine, Cefotetan, Fosfomycin, Acriflavin): 500g/ CHAI Code: BK110HA Oxford Selective Supplement (CCCFA) 10 lọ / HỘP Code: BS00308 X. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Curtis G.D.W., Mitchell R.G., King A.F., and Griffin E.J. 1989. A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes. Letters in Appl. Microb., 8: 95-98. Curtis G.D.W., Nichols W.W., and Falla T.J. 1989. Selective agents for Listeria can inhibit their growth. Letters in Appl. Microb., 8: 169-172. Tiwari, N.P. and Aldenrath S.G. 1990. Isolation of Listeria monocytogenes from Food Products on Four Selective Plating Media. Journ. of Food Protection, 53: 382-385. Journal Officiel du 7 Avril 1992. Contrôle microbiologique des produits végétaux ou d origine végétale. (arrêté du 13 mars 1992). NF EN ISO 11290-1. Juillet 2017. Microbiologie de la chaîne alimentaire - Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes et Listeria spp. - Partie 1 : méthode de recherche. XI. TÀI LIỆU THÊM Các thông tin ghi trên bao bì được ưu tiên hơn so với các công thức, hướng dẫn mô tả trong tài liệu và dễ bị thay đổi bất cứ lúc nào mà không báo trước Mã tài liệu: MUELLER HINTON BROTH_ENv8 Ngày tạo: 01-2003 Cập nhật: 05-2016 Nguồn gốc của bản sửa đổi: Cập nhật chung XII. HÌNH ẢNH MINH HỌA Tham khảo: BK110HA + BS00308 Kết quả ủ trong 48h tại 37 0 C PHỤ LỤC HÌNH ẢNH