BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH...3 CHỮ VIẾT TẮT 6 LỜI MỞ ÐẦU 7 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về kh

Bản ghi

1 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH...3 CHỮ VIẾT TẮT 6 LỜI MỞ ÐẦU 7 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ Tổng quan về các phương pháp Karyotype Sinh học phân tử...14 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Karyotype Vật liệu Dụng cụ và thiết bị Hóa chất Quy trình Sinh học phân tử QF-PCR FISH Real time PCR 33 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 1

2 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Karyotype Sinh học phân tử QF PCR FISH Realtime PCR chẩn đoán HPV.42 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN...44 TÀI LIỆU THAM KHẢO...45 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 2

3 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các giai đoạn của 1 phản ứng PCR 17 Hình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền..20 Hình 3. FISH chẩn đoán nhanh hội chứng Down, Patau, Edward, Turner, Kleinerfelter trong chẩn đoán trước sinh. Thai nhi mắc hội chúng Patau (trisomy 13)..23 Hình 4. Lấy máu ngoại vi ở người lớn.24 Hình 5. Lấy máu ngoại vi ở trẻ 24 Hình 6. Cấy máu...25 Hình 7. Dung dịch Demecolcine..26 Hình 8. Ly tâm 1800 rpm trong 8 phút.26 Hình 9. Nhỏ KCl vào mẫu trong ống ly tâm...26 Hình 10. Nhỏ axit acetic vào mẫu đã được ly tâm 27 Hình 11. Sau khi cho dung dịch carnoy vào lần 2 27 Hình 12. Dung dịch có màu trắng khi nhỏ dung dịch Carnoy lần 3.27 Hình 13. Nhỏ lame (kiểu nhỏ ngang)...28 Hình 14. Nhỏ lame cao (kiểu nhỏ cao).28 Hình 15. Nhuộm lame bằng Giemsa: buffer.28 Hình 16. Quan sát NST dưới kính hiển vi 29 Hình 17. Ống type được đánh số theo mã số của ống chứa dịch ối.31 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 3

4 Hình 18. Mẫu được lắc ủ 99 0 C 800rpm trong 10 phút.31 Hình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọc.31 Hình 20. Nhỏ dung dịch wash buffer type Hình 21. Máy PCR...32 Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm...33 Hình 23. Cho vào máy lai PCR 35 Hình 24. Gỡ keo sau lai 35 Hình 25. Đánh mã số cho mẫu..36 Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2.37 Hình 27. Máy trích ly DNA tự động.38 Hình 28. Nhỏ mẫu vào Plate...38 Hình 29. Plate đựng mẫu và dung dịch AW Hình 30. Kết quả NST trên màn hình vi tính chưa sắp xếp.39 Hình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếp.39 Hình 32. Kết quả NST in trên giấy...40 Hình 33. Kết quả Trisomy XXX...41 Hình 34. Kết quả bị hội chứng Turner..41 Hình 35. Kết quả bị hội chứng Klinefelte...41 Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down) Hình 37. Kết quả Trisomy 13 (hội chứng Patau)...42 Hình 38. Kết quả Trisomy 18 (hội chứng Edward)...42 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 4

5 Hình 39. Kết quả FISH NST 21 và NST 13 bình thường. 43 Hình 40. Kết quả FISH 3 NST 21 hội chứng down..43 Hình 41. Kết quả FISH NST XX và NST 18 bình thường...43 Hình 42. Kết quả FISH NST XY và NST 18 bình thường...43 Hình 43. Kết quả âm tính..45 Hình 44. Kết quả dương tính...45 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 5

6 CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT NST NỘI DUNG Nhiễm sắc thể GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 6

7 LỜI MỞ ÐẦU Trong sự phát triển của mỗi quốc gia hiện nay, ngành Y nắm một vai trò vô cùng quan trọng. Không những đóng góp to lớn cho nền kinh tế mà ngành Y còn góp phần củng cố mặt đời sống nhân sinh cho quốc gia đó. Với một quốc gia khỏe mạnh về thể chất người lao động, quốc gia đó mới có chỗ dựa vững chắc để phát triển mạnh mẽ nền kinh tế của mình. Cùng với sự tiến triển của khoa học, bệnh di truyền ngày càng được mọi người chú ý. Theo thống kê của nhi khoa, gần 20 năm nay, tỉ lệ trẻ em chết vì bệnh di truyền đã giảm mạnh, cò tỉ lệ trẻ phát bệnh và tỷ lệ tử vong do dị tật bẩm sinh và bệnh di truyền dần dần tăng cao. Trong quá trình phát triển tự nhiên của nhân loại, do ảnh hưởng của các nhân tố, làm cho chất di truyền trong cơ thể biến đổi. Trong những biến đổi này có một loại biến đổi về con số và kết cấu của nhiễm sắc thể nhân tế bào được gọi là dị dạng nhiễm sắc thể, một loại khác là đột biến gen. Vì vậy tất cả bệnh do nhiễm sắc thể và gen trong nhân tế bào biến dạng gây cản trở cho sự thay thế, gây ra sự thiếu hụt dung môi có liên quan dẫn đến cơ thể di truyền sang đời sau, tạo nên sự hỗn hợp về sinh lý nhân thể, cơ năng sinh hóa, gây cản trở quá trình thay thế, loại bệnh này uy hiếp sức khỏe của con người. Vì thế việc xét nghiệm sớm trước sinh là việc rất quan trọng nhằm ngăn chặn việc sinh con bị tật gây nên gánh nặng cho gia đình và xã hội. Với nội dụng thực tập tốt nghiệp: một số kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán các bệnh tại khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ TpHCM. Chúng em đã hiểu rõ hơn các kỹ thuật xét nghiệm một số bệnh và quan trọng hơn là đã trải nghiệm thực tế nâng cao tay nghề hơn biết được sự khác nhau giữa lý thuyết và thực tế. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 7

8 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Giới thiệu về khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ Bệnh viện Từ Dũ là bệnh viện đầu ngành về sản phụ khoa của cả nước, đồng thời là trung tâm sản phụ khoa lớn nhất khu vực phía Nam tọa lạc tại 284 Cống Quỳnh, phường Phạm Ngũ Lão, quận 1, Tp.HCM. Trong đó khoa xét nghiệm di truyền y học tự hào là đơn vị đi đầu cả nước về di truyền người và chẩn đoán trước sinh. Di truyền và sinh học phân tử là chuyên khoa mũi nhọn của bệnh viện Từ Dũ, là lĩnh vực tiên phong trong xu hướng phát triển y học của thế giới. Khoa có đội ngũ cán bộ y tế trẻ giỏi, có đầy đủ các thiết bị xét nghiệm sàng lọc và chẩn đoán gen hiện đại. Khoa xét nghiệm di truyền y học được thành lập ngày 8/10/2010 từ tiền thân là buồng di truyền thuộc khoa giải phẫu bệnh - tế bào - di truyền, gồm 2 bộ phận chính: -Xét nghiệm sàng lọc: sàng lọc trước sinh (double test và combined test, triple test) và sàng lọc sơ sinh (thiếu G6PD, suy giáp bẩm sinh, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh). -Xét nghiệm gen và nhiễm sắc thể: karryotube, QF-PCR, FISH, đột biến gen Thalassemia, loạn dưỡng cơ Duchenne, Digeorge, AZF, SRY, Hemophilia, nhận dạng gen người, đột biến gen sẩy thai, HPV, Rubella PCR, CMV PCR, Toxoplasma PCR và nhiều bệnh khác (nguồn: Sơ đồ quy trình xét nghiệm của khoa - Sơ đồ quy trình xét nghiệm karyotube +Lấy mẫu: Tiếp nhận bệnh nhân, ghi thông tin, lấy mẫu hoặc nhận mẫu lừ các nơi gửi đến, và ký nhận. không. +Kiểm tra: Kiểm tra mẫu máu lấy có đạt yêu cầu thực hiện xét nghiệm GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 8

9 +Nhập liệu: Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng mẫu. +Thực hiện xét nghiệm: Thực hiện xét nghiệm theo quy trình kỹ thuật xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ máu gồm các bước nuôi cấy 72 giờ, thu hoạch và chuẩn bị lam 2 ngày, đọc và phân tích. Lấy mẫu Không đạt Kiểm tra Đạt Nhập liệu Thực hiện xét nghiệm Ra kết quả Không đạt Kiểm tra kết quả Đạt Nhập kết quả Tư vấn Trả về nơi giới thiệu hoặc điều trị chuyên khoa Lưu hồ sơ Kết thúc +Ra kết quả xét nghiệm. +Kiểm tra kết quả, nếu không đạt thì lấy mẫu lại. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 9

10 +Nhập kết quả xét nghiệm và in phiếu trả kết quả qua phần mềm nhiễm sắc thể đồ máu cho bệnh nhân. +Tư vấn về mặt di truyền cho bệnh nhân: Tranh ảnh, tài liệu tư vấn. +Chuyển bệnh nhân về lại nơi chỉ định xét nghiệm hoặc nơi có điều trị chuyên khoa phù hợp. +Lưu hồ sơ. -Sơ đồ quy trình xét nghiệm sinh học phân tử Nhận mẫu Kiểm tra thông tin Nhập liệu Ly trích DNA PCR Chạy điện di Ra kết quả và phân tích Trả kết quả bệnh nhân +Nhận mẫu: Nhận mẫu dịch ối, mẫu máu, gai nhau từ các khoa khác tại bệnh viện. +Kiểm tra thông tin: Thông tin trên ống chứa mẫu với thông tin trên giấy, nếu không khớp thì báo lại. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 10

11 mẫu. +Nhập liệu: Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng +Ly trích DNA: Dùng các bộ kit để thu được DNA. +Chạy PCR: Cho DNA vào máy chạy PCR +Điện di: Tùy xét nghiệm mà chạy điện di gel hoặc điện di mao quản từ sản phẩm PCR +Ra kết quả và phân tích: Nếu đạt yêu cầu in trả kết quả bệnh nhân, nếu kết quả bị nghi ngờ là sai thì chạy mẫu lại. 1.2.Tổng quan về các phương pháp Karyotype Xét nghiệm karyotube hay Lập bộ nhiễm sắc thể là xét nghiệm khảo sát bộ nhiễm sắc thể trong 1 tế bào. Xét nghiệm được thực hiện bằng cách nuôi cấy tế bào trong môi trường đặc biệt. Sau thời gian thích hợp tế bào được thu hoạch và được nhuộm đặc trưng. Kỹ thuật nhuộm hiện nay là GTG (Giemsa trypsin G-banding). Người bình thường có 46 nhiễm sắc thể, chia thành 22 cặp thường và 1 cặp giới tính. Mỗi cặp có kích thước, hình dạng và cấu trúc đặc trưng. Sau khi nhuộm, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể được khảo sát bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần và được phân tích, xếp thành bộ hoàn chỉnh bằng phần mềm chuyên dụng. Loại mẫu có thể sử dụng cho kỹ thuật này gồm: máu, dịch ối, gai nhau, dây rốn, máu dây rốn. Karyotube được chỉ định xét nghiệm cho tất cả các đối tượng nghi ngờ bị rối loạn di truyền, dị tật bẩm sinh, chậm phát triển tâm thần, vô sinh hiếm muộn, sẩy thai liên tiếp Tiêu chuẩn để xếp loại nhiễm sắc thể trong lập karyotube GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 11

12 Lúc đầu người ta chỉ căn cứ vào chiều dài của NST để căn cứ và đặt tên cho chúng từ 1 đến 23 theo thứ tự từ dài đến ngắn (công ước Denver 1960), nhưng ngay sau đó cũng năm 1960 Patau không đồng ý và đề xuất thêm tiêu chuẩn vị trí phần tâm, sau này được quốc tế chính thức chấp nhận. Phân loại nhiễm sắc thể Ở người bộ NST 2n = 46 trong đó có 22 cặp NST thường (autochromosome) và 1 cặp NST giới tính (sex chromosome). Dựa vào đặc điểm hình thái như độ dài, vị trí tâm động người ta sắp xếp các NST thành từng nhóm. 46 NST người được chia thành 7 nhóm, kí hiệu là A, B, C, D, E, F và G trên nguyên tắc dài trước ngắn sau, nếu các NST bằng nhau thì tâm giữa đặt trước, tâm lệch đặt sau: -Nhóm A có 3 cặp NST có kích thước lớn nhất, gọi tên từ số 1 đến 3, cặp số 1 tâm giữa, cặp số 2 tâm lệch, cặp số 3 tâm giữa. lệch. - Nhóm B có 2 cặp NST số 4 và 5. Các NST này có kích thước lớn và đều có tâm -Nhóm C có 7 cặp từ số 6 đến 12 có chiều dài trung bình. NST X cũng được xếp vào nhóm này. Tất cả đều tâm gần giữa và khó phân biệt. -Nhóm D có 3 cặp từ số 13 đến 15 gồm các NST có nhánh ngắn rất ngắn, gần như không đáng kể gọi là các NST tâm đầu (acrocentric). Tất cả 3 cặp NST này đều có vệ tinh ở nhánh ngắn. lệch. -Nhóm E có 3 cặp 16, 17,18 tương đối ngắn. NST số 16 tâm giữa, 17 và 18 tâm -Nhóm F có 2 cặp NST 19 và 20, ngắn và có tâm giữa. -Nhóm G có 2 cặp 21 và 22, kích thước ngắn và tâm đầu, có vệ tinh. NST Y cũng được xếp vào nhóm này nhưng không có vệ tinh. Các rối loạn về bộ nhiễm sắc thể người Rối loạn số lượng GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 12

13 -Đa bội thể: là hiện tượng tăng chẵn hoặc tăng lẻ cả bộ NST. Ví dụ: ở người 3n = 69 NST là thể tam bội (3n) thuộc dạng thể đa bội lẻ, 4n = 96 NST = thể tứ bội (4n) thuộc dạng thể đa bội chẵn. Ở người, các trường hợp đa bội phần lớn phôi thai chết ở giai đoạn trước sinh, một vài trường hợp sống đến khi sinh hoặc sau sinh nhưng hầu hết là các sơ sinh bị dị tật. -Lệch bội: là hiện tượng số lượng NST của tế bào tăng lên hoặc giảm đi một hoặc vài NST so với bộ NST lưỡng bội. Rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể -Mất đoạn (deletion): là hiện tượng NST bị đứt rời ra một hoặc nhiều đoạn, đoạn bị đứt rời ra không có tâm sẽ tiêu biến đi hoặc gắn sang NST khác, phần còn lại mang tâm trở lên ngắn hơn bình thường. Mất đoạn gồm các dạng: mất đoạn cuối đơn, mất đoạn cuối kép, mất đoạn giữa. -Chuyển đoạn (Translocation) Chuyển đoạn là hiện tượng trao đổi các đoạn của NST. Chuyển đoạn NST đã được xác định là hay gặp nhất trong rối loạn cấu trúc của NST [63]. Có hai kiểu chuyển đoạn là chuyển đoạn tương hỗ (reciprocal translocation) và chuyển đoạn hòa hợp tâm (Robertsonian translocation). -Lặp đoạn (duplication) là hiện tượng một đoạn nào đó của NST được nhân đôi lên. Lặp đoạn xảy ra khi 2 NST tương đồng ghép đôi với nhau không tương xứng trong kỳ đầu của phân bào giảm phân, có sự đứt của 2 NST và trao đổi đoạn giữa 2 đoạn khác nhau của 2 NST trong cặp tương đồng. Trong trường hợp này có 2 NST bị thay đổi cấu trúc, nhưng không mất đi hoặc tăng thêm vật liệu di truyền trong tế bào. Khi các NST trong cặp tương đồng này phân ly nhau trong giảm phân sẽ tạo ra hợp tử mang NST lặp đoạn (trisomi từng phần) hoặc NST thiếu một đoạn có liên quan (monosomi từng phần) -Đảo đoạn (invertion) là sự bất thường cấu trúc do NST bị đứt ở hai điểm, đoạn giữa hai điểm đứt quay ngược 1800 rồi nối lại, do đó một số gen bị đảo ngược thứ tự so với đoạn ban đầu. Có ba kiểu đảo đoạn: đảo đoạn ngoài tâm, đảo đoạn quanh tâm đối xứng, đảo đoạn quanh tâm không đối xứng. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 13

14 +Đảo đoạn ngoài tâm: hai chỗ đứt ở cùng một nhánh của NST và đoạn đảo không chứa tâm, NST không thay đổi hình thái. +Đảo đoạn quanh tâm đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh và cách đều tâm, NST không thay đổi hình thái. + Đảo đoạn quanh tâm không đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh, khoảng cách tâm không đều nhau, NST có cấu trúc lại và thay đổi hình thái Sinh học phân tử QF-PCR QF-PCR là PCR huỳnh quang định lượng (Quantitative Fluorescence PCR). Đây là một kỹ thuật PCR dùng để khuếch đại các đoạn DNA ngắn lặp lại đặc hiệu (STR), đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượng bằng điện di mao quản. QF-PCR được dùng để kiểm tra liều gen, ví dụ: số lượng bản sao của gen trong 1 mẫu khảo sát, số lượng của các đoạn nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể thường được khảo sát bằng QF-PCR là nhiễm sắc thể (NST) 13, 18, 21, X, Y. Mỗi NST sẽ được khảo sát tại nhiều đoạn STR khác nhau. Do các locus STR thường được chọn có đặc tính đa hình cao nên ít khi xảy ra trường hợp trisomy cho kết quả dạng đồng hợp tử ở tất cả các đoạn STR không thể kết luận được. Prenatal Lab sử dụng QF-PCR khảo sát 32 đoạn STR khác nhau trên các NST 13, 18, 21, X và Y. Hiện nay QF-PCR thường được chỉ định trong chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể cho các trường hợp thai nguy cơ cao bị Hội chứng Down, Hội chứng Edwards, Hội chứng Turner, Hội chứng Klinefelter Loại mẫu có thể sử dụng cho kỹ thuật này gồm: máu, dịch ối, gai nhau, dây rốn, máu dây rốn, mô thai sảy -Nguyên tắc của phương pháp PCR: Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 14

15 DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của 1 trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại 1 trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer). -Thực nghiệm: Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là C trong vòng 30 giây 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính. Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Các mồi được thiết kế sao cho đầu 3 định hướng đoạn trình tự cần nhân nên quá trình tổng hợp ADN sẽ diễn ra trên cả hai mạch, qua suốt vùng trình tự đó; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 0 C 70 0 C, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai. Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72 0 C giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. ADN polymerase gắn vào đầu 3 tự do của mồi và sử dụng dntp để tổng hợp các mạch mới theo chiều 5 3. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài. Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là kỹ thuật khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 10 6 so với số lượng bản mẫu ban đầu (Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục). GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 15

16 -Các điều kiện của phản ứng PCR Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau: ADN khuôn, mồi, DNA polymerase, các deoxyribonucleotit triphosphat (dntp), dung dịch đệm (buffer). -Điện di mao quản: +Nguyên tắc của sự tách Dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất phân tích trong mao quản (ɸ:25-100mm) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm ph thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 10-30kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CE là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao. +Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vì điện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác nhau. Hình 1. Các giai đoạn của 1phản ứng PCR (Nguồn: GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 16

17 Real time PCR (xét nghiệm HPV) Siêu vi sinh dục papilom ở người (Human Papillomavirus) còn gọi là siêu vi HPV, là siêu vi thông thường gây nhiễm trùng tế bào da. Thông thường, cơ thể sẽ tự chống lại siêu vi HPV trước khi chúng có thể gây ra những vấn đề sức khỏe. Vì lý do này, hầu hết những người bị nhiễm siêu vi HPV không có triệu chứng và không biết mình đã bị nhiễm bệnh. Nhưng đôi khi cơ thể không tự chống lại siêu vi HPV. Trong những trường hợp này, siêu vi HPV có thể gây ra các vấn đề cho sức khỏe, như: Mụn cóc sinh dục ở đàn ông và phụ nữ; ung thư cổ tử cung ở phụ nữ; những loại ung thư ít phổ biến khác ở đàn ông và phụ nữ, như ung thư hậu môn. Siêu vi HPV làm cho những tế bào bình thường trong cơ thể trở nên bất thường. Người ta không thể nhìn thấy hay cảm thấy những tế bào bất thường này. Hầu hết các trường hợp, cơ thể sẽ tự chống lại siêu vi HPV và các tế bào sẽ trở lại bình thường. Nhưng nếu không thì siêu vi HPV có thể biến tế bào thành ung thư theo thời gian. Sau nhiều năm thì ung thư mới phát triển ở một người bị nhiễm siêu vi HPV. (Nguồn: Marina D.M Lima a, b, Paulo Henrique Braz-Silva a, c, Sônia M. Pereira d, Catalina Riera e, Ariane C. Coelho f, Marina Gallottini a 2014, Oral and cervical HPV infection in HIV-positive and HIV-negative women attending a sexual health clinic in São Paulo, Brazil ) Giới thiệu chung Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 17

18 được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học lớn. Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA). Real-time PCR định lượng còn được biết như là qpcr. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ. Phân tích tổng quát một phản ứng Real-time PCR Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong khuếch đại mẫu. Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại trong tube, được trình bày trong trục y. Đường cong khuếch đại có 2 pha, 1 pha hàm mũ được tiếp theo bởi một pha ổn định. Trong suốt pha hàm mũ, số lượng PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm cho một hoặc nhiều thành phần bị hạn chế. Ở điểm nàu phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn định (các chu kỳ 28-29). Hình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 18

19 Đầu tiên tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền, và việc tăng tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1-18) cho dù sản phẩm tích lũy theo hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu kỳ ngưỡng (C T ). Do đó giá trị C T được đo trong pha hàm mũ khi các tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên real-time PCR có thể được sử dụng để tính toán chính xác và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng. C T được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện ở lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài chu kỳ khuếch đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên background. Vì vậy, phản ứng sẽ có C T thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn mẫu lúc bắt đầu phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng trên background. Vì vậy phản ứng sẽ có C T cao hoặc muộn. Các dạng quan hệ này là cơ sở cho hướng định lượng của real-time PCR. Một số ứng dụng chính của real-time PCR -Nghiên cứu biểu hiện gen. Xác định sự hoạt động của gen và định lượng mức độ biểu hiện của nó thông qua RNA bằng kỹ thuật RT-PCR -Chuẩn đoán phân tử. Nghiên cứu mức độ nhiễm virus và vi khuẩn để chuẩn đoán các bệnh viêm nhiếm. -Xét nghiệm phân biệt allele. Là phương pháp xét nghiệm đầu cuối được dùng để xác định kiểu gen của mẫu vật (đồng hợp tử: chỉ có allele 1 hoặc chỉ có allele 2, dị hợp tử: có cả 2 allele 1 và 2) và phân biệt sự đa hình nucleotide đơn Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH): FISH (Fluorescent insitu hybridization) là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử, sử dụng một đoạn mồi đặc hiệu (probe) gắn tín hiệu huỳnh quang, để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc thể, với ưu điểm nhanh, đặc hiệu và chính xác. FISH đặc biệt có hiệu quả trong việc phát hiện những mất đoạn gen nhỏ (microdeletion), hoặc để khẳng định nguồn gốc của các loại chuyển đoạn đặc GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 19

20 biệt. Ngoài ra interphase FISH (FISH nhanh) còn được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán trước sinh, để phát hiện những bất thường số lượng của một số nhiễm sắc thể thường gặp (13,18,21,X,Y) Kỹ thuật FISH được chỉ định trong các trường hợp sau: Chẩn đoán trước sinh các bất thường số lượng NST ở thai nhi, phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di truyền, xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc, phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư. Kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trƣớc sinh: Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) được sử dụng để sàng lọc một số hội chứng di truyền thường gặp: hội chứng Down (trisomy 21), hội chứng Patau (trisomy 13), hội chứng Edward (trisomy 18), hội chứng Turner (monosomy X), hội chứng Kleinerfelter (XXY) với ưu điểm: -Nhanh: Thời gian xét nghiệm trong vòng 48h kể từ khi nhận mẫu dịch ối. Hoàn thành các thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau 4 ngày. Chú ý: Các quyết định đình chỉ thai nghén không nên chỉ dựa vào một mình kết quả FISH -Độ chính xác cao -Yêu cầu chỉ 10-20ml dịch ối. -Có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm gai nhau. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 20

21 Hình 3. FISH chẩn đoán nhanh hội chứng Down, Patau, Edward, Turner, Kleinerfelter trong chẩn đoán trước sinh. Thai nhi mắc hội chúng Patau (trisomy 13) GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 21

22 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Karyotype: Vật liệu: Mẫu máu từ các cặp vợ chồng, đứa trẻ có nghi ngờ đột biến nhiễm sắc thể, dịch ối từ các bà mẹ mang thai Dụng cụ và thiết bị: Kính hiển vi, lam kính, máy ly tâm, ống chứa máu chân không, kim tiêm, bể cách thủy có lắc, tủ lạnh, Pipetman, đầu côn, cồn tuyệt đối, máy sấy lam, tủ ấm, máy in, tủ cấy an toàn sinh học cấp Hóa chất: Trypsin, PBS, Buffer, Giemsa, KCl 7,5%, Demecolcine, Acid acetic 5%, Methanol, Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic nguyên chất), dầu soi kính Quy trình: - Bước 1: Lấy mẫu Tiếp nhận bệnh nhân, ghi thông tin, lấy mẫu hoặc nhận mẫu lừ các nơi gửi đến, và ký nhận. Xác định chổ cần lấy máu, dùng kim tiêm đâm vào mạch máu ở tay lấy máu ngoại vi, lấy gần 2/3 ống máu, lắc đều. Tốt nhất lấy máu và cấy máu Hình 4. Lấy máu người lớn Hình 5. Lấy máu em bé GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 22

23 trong ngày. Trong trường hợp ở xa máu khi đã tách lớp phải được bảo quản lạnh ở 4 0 C có chất chống đông heparin. -Bước 2: Kiểm tra Kiểm tra mẫu máu lấy có đạt yêu cầu thực hiện xét nghiệm không. -Bước 3: Nhập liệu Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng mẫu -Bước 4: Thực hiện xét nghiệm: Cấy mẫu -> Thu hoạch -> Nhỏ lam -> Nướng lam -> Nhuộm lam -> đọc lam, phân tích kết quả. +Cấy mẫu: Hút 0,5-1 ml máu (hút lấy phần trắng ở giữa các tế bào máu và huyết tương khi máu đã tách lớp) cho vào 8ml môi trường nuôi cấy sau đó đậy kín để tủ ấm 37 0 C trong 3 ngày. Hình 6. Cấy mẫu Cấy mẫu -> Thu hoạch -> Nhỏ lam -> Nướng lam -> Nhuộm lam -> đọc lam, phân tích kết quả. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 23

24 +Cấy mẫu: Hút 0,5-1 ml máu (hút lấy phần trắng ở giữa các tế bào máu và huyết tương khi máu đã tách lớp) cho vào 8ml môi trường nuôi cấy sau đó đậy kín để tủ ấm 37 0 C trong 3 ngày. Hình 7. Dung dịch Demecolcine Hình 8. Ly tâm 1800 rpm trong 8 phút Cho tiếp 8 10 ml KCl 7,5%, ủ 37 0 C trong 30 phút, ly tâm 1800 vòng/phút trong 8 phút rồi hút bỏ dịch nổi. Hình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâm Nhỏ thêm 5ml axit acetic 5%: vừa lắc vừa nhỏ từng giọt, ly tâm 1800 vòng/phút trong 8 phút tiếp tục hút bỏ dịch nổi. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 24

25 Hình 10. Nhỏ axit acetic Cho vào ống dung dịch canoy, ủ ở ngăn đá 20 phút, ly tâm 1800 vòng/ 8 phút, hút bỏ dịch nổi. Nếu dung dịch chưa có màu trắng thì lặp lại cho dung dịch carnoy thêm 1 đến 2 lần nữa rồi đem đi ly tâm liền ở 1800 vòng/ 8 phút rồi hút bỏ dịch nổi. Hình 11. Sau khi chi dung dịch carnoy vào lần 2 Hình 12. Dung dịch có màu trắng Khi nhỏ dung dịch Carnoy lần 3 +Nhỏ lam: Có 2 cách nhỏ lam: Nhỏ cao (nhỏ từ trên cao xuống) và nhỏ ngang ( nhỏ chạm trên mép lam kính đập). Đầu tiên lấy lam kính từ trong cồn tuyệt đối để lạnh rửa lần lượt qua 2 hủ đá có nước rồi sau đó lấy pipet hút mẫu nhỏ lên lam kính nếu nhỏ cao thì khi nhỏ xong để lên máy sấy lam khoảng 55 0 C, nếu nhỏ ngang thì khi nhỏ xong phải đập lam kính rồi GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 25

26 để trên máy sấy lam 55 0 C. Khi lam kính khô lấy ra để ở nhiệt độ phòng khoảng 2 ngày rưỡi 3 ngày. +Nướng lam: Hình Để 13. lam Nhỏ kính ngang vào trong tủ ấm ở 80 0 C trong Hình phút. Nhỏ cao +Nhuộm lam: Lam kính được nhúng trong trypsine để trong bể 37 0 C trong vòng khoảng 14, 16, 18, 20, 22 giây để test lam xem thử ở thời gian nào sẽ quan sát được NST đẹp nhất, chọn ra để làm cho tất cả mẫu trong ngày. Sau đó nhúng vào 2 hủ PBS lạnh sau đó để ráo. Pha dung dịch buffer: Giemsa với tỷ lệ 9 buffer : 1 giemsa. Hút dung dịch này nhỏ đầy lên lam kính đợi phút. Rửa nước, để khô. Hình 15. Nhuộm lam bằng Giemsa : buffer +Phân tích, đọc kết quả: GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 26

27 Đem lên kính hiển vi quan sát ở thấu kính 10 để xác định NST sau đó chỉnh sang thấu kính 100 để phân tích. Hình 16. Quan sát dưới kính hiển vi -Bước 5: Ra kết quả Một bệnh nhân lấy 25 mẫu NST lựa chon 10 bộ đẹp nhất đem đi phân tích ra kết quả -Bước 6: Kiểm tra kết quả Kiểm tra các bộ NST có đủ 22 cặp không. Nếu không đạt thì lấy mẫu lại. -Bước 7: Nhập kết quả Nhập kết quả xét nghiệm và in phiếu trả kết quả qua phần mềm nhiễm sắc thể đồ máu cho bệnh nhân. -Bước 8: Tư vấn Tư vấn về mặt di truyền cho bệnh nhân: Tranh ảnh, tài liệu tư vấn. -Bước 9: Chuyển bệnh nhân về lại nơi chỉ định xét nghiệm hoặc nơi có điều trị chuyên khoa phù hợp -Bước 10: Lưu hồ sơ. 2.2.Sinh học phân tử GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 27

28 2.2.1.QF-PCR Vật liệu: Dịch ối từ các thai phụ có nguy cơ cao về rối loạn NST được tư vấn và đồng ý tham gia chọc ối tại bệnh viện Từ Dũ Dụng cụ và thiết bị: Tube vô trùng các loại 200μl, 500μl và 1,5ml; Pipette: 0,5 10μl, 2 20μl, μl, μl (Eppendorf) và đầu côn tương ứng; Lam kính; Máy vortex; Máy ly tâm (Eppendorf); tủ mát C; Máy định lượng DNA Biophotometer Plus (Eppendorf); Máy luân nhiệt Mastercycler (Eppendorf); Hệ thống điện di mao quản ABI 3500/ABI 3130 (Applied Biosystems); Máy vi tính, máy in, phần mềm phân tích đoạn DNA GeneMarker (SoftGenetics) Hóa chất: Proteinase K, Buffer lysis type 10, Elution buffer type 5, lysis buffer type 6, Instagene matrix, Hi-di-Fomamide, 560 sizer orange Cách tiến hành: -Ly trích DNA: +Đối với kit Instagene Matrix: Dịch ối được ly tâm 1500 rpm/ 5 phút. Chuẩn bị ống tube 1,5 ml đánh mã số cho khớp với ống chứa dịch ối. Hút 200µl dịch ối chứa cặn vào tube đem ly tâm rpm trong 1 phút, hút bỏ nước lấy cặn. Bổ sung khoảng µl Instagene Matrix, là một hạt silica có từ tính dung để phá vỡ tế bào bằng va chạm khi ly tâm và thu DNA bằng cách hoạt tính từ hút DNA. Đem lắc 1300 rpm trong 3 phút, spin rồi lắc ủ 99 0 C/ 800rpm/ 10 phút để DNA có thể gắn trên các hạt từ. Tiếp đó lắc 800 vòng/ 3 phút, ly tâm 12000rpm/ 2 phút để loại bỏ các cặn. Sau đó đi rửa WE nóng ( bản chất là nước tinh khiết có nồng độ NaCL thấp để phá vỡ lien kết DNA và hạt từ). Ta thu được DNA trong dung dịch. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 28

29 Hình 17. Ống type được đánh số theo mã số của ống chứa dịch ối Hình 18. Mẫu được lắc ủ 99 0 C 800rpm trong 10 phút +Đối với Kit GE: Ly tâm dịch ối 1500 rpm/ 5 phút. Hút 20 µl Proteinase K vào ống tube 1.5. Hút 200 µl cặn dịch ối, đối với máu thì hút phần ở giữa phần tách lớp các tế bào màu và huyết tương, thêm 400 µl lysis byuffer tube 10 vortex kỹ, lắc 1500 rpm/10 phút, ủ ở nhiệt độ phòng/ 10 phutút. ( để enzyme xúc tác ly giai màng tế bào phá vỡ màng tế bào bằng phương pháp sinh học ) Chuẩn bị hút 200 µl dung dịch elution buffer type 5( nước tinh khiết có nồng độ NaCL thấp) vào ống tube mới ủ ở 70 0 C. dung dịch rửa Chuyển toàn bộ mẫu ủ qua ống tube khác có màng lọc, ly tâm 14000rpm/1 phút lúc này hỗn hợp gồm protein, DNA,RNA, các mảng vở tế bào, vvv loại bỏ nước loại bỏ tạp chất có trong nước,dna RNA được giữ lại trên màng lọc. Bổ sung 500 µl lysis buffer type 10 kết tủa protein loại bỏ tạp chất con lại có trong màng lọc, ly tâm rpm/1 phút bỏ nước, tiếp tục cho 500 µl wash buffer type 6 ( ethanol) để loại bỏ lysis buffer type 10, ly tâm rpm/ 1 phút, rồi tiếp tục ly tâm rpm/3 phút. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 29

30 Hình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọc Hình 20. Nhỏ dung dịch wash buffer type 6 Chuyển màng lọc qua ống tube mới, cho vào đó 200 µl elution buffer tube C đã chuẩn bị truước đó, ủ nhiệt độ phòng trong 1 phút mục đích để ly giải sự gắn kết giữa DNA và silica trên màng lọc làm DNA không gắn trên màng nữa, đem ly tâm rpm trong 1 phút, lấy nước bỏ màng lọc. Thu được DNA trong dung dịch. -Chạy PCR Chuẩn bị 2 loại tube có chứa 2 loại mastermix một loại chứa NST 13, 18, 21, một loại chứa cho NST giới tính X, Y, 13, 18, 21 đem rả đông. Hút 1,5-2 µl dịch trong của mẫu cho vào lần lượt 2 tube chứa 2 mastermix. Đưa mẫu vào máy chạy QF-PCR Mỗi mẫu sẽ được chạy 2 phản ứng PCR đa mồi riêng biệt trong bộ Devyser Complete, chạy xong lấy mẫu ra. Hình 21. Máy PCR GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 30

31 -Điện di: Chuẩn bị ống tube, hút 600 µl Hi-Di-Formamide cộng với 12 µl 560 sizer orange. Hút 12 µl hỗn hợp vào mỗi giếng và thêm 0,9 µl mẫu và đưa vào máy chạy điện di mao quản theo chu trình điện di của phân tích đoạn với: Điện thế bơm mẫu: 2,5V; Thời gian bơm mẫu: 20 giây, điện thế điện di: 15V; thời gian điện di: 30 phút Dữ liệu sau khi điện di mao quản được xuất dưới dạng tập tin.fsa và được phân tích kết quả trisomy bằng phần mềm GeneMarker Tất cả các tiêu chuẩn phân tích, đánh giá được căn cứ theo Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch bội bằng QF-PCR (2007) của Hiệp hội Di truyền Lâm sàng Vương quốc Anh, ra kết quả và trả cho bệnh nhân FISH Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR Khi xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR không cho kết quả hoặc kết quả không rõ ràng thì tiến hành thêm kỹ thuật FISH. Nguyên tắc: Sử dụng các đoạn dò được đánh dấu chất phát huỳnh quang bắt cặp chuyên biệt với một vùng NST đặc hiệu. Dưới kính hiển vi huỳnh quang, các vị trí đoạn dò huỳnh quang gắn với NST sẽ được phát hiện. Dựa vào số lượng tín hiệu màu GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 31

32 huỳnh quang để xác định số lượng các NST: tế bào 2n cho 2 tín hiệu, tế bào bất thường cho ít hơn hoặc nhiều hơn 2 tín hiệu Vật liệu: Dịch ối từ các thai phụ Dụng cụ và thiết bị: Kính hiển vi, lam kính, Lamelle, máy ủ nhiệt, máy ly tâm, máy ổn nhiệt có lắc, pipetman, đầu côn, máy sấy lame, máy lai FISH Hóa chất: Trypsin-EDTA 1X (GIBCO), Dung dịch KCl 0,075M, Dung dịch carnoy, Sử dụng bộ kit FISH thương mại VYSIS (Mỹ), DAPI, NP40 0,3%, NP40 0,1%, SSC 2X, Pepsine, PBS, FA, Ethanol, prenatal X, Y and 18 enumeration Probe và prenatal 13 and 21 enumeration Probe, Keo, Antifate Cách tiến hành: -Ly tâm dịch ối 1800 rpm trong 8 phút. -Thu hoạch gồm các bước: Hút bỏ dịch, lấy cặn, nhỏ 2ml trypsine ủ ở 37 0 C trong 10 phút, ly tâm 1800 vòng/12 phút hút bỏ dịch nổi lấy cặn, bổ sung thêm 8-10ml KCl 7,5%, ủ 37 0 C/40 phút ly tâm hút bỏ dịch nổi ở những bước sau cũng làm tương tự như cách thu hoạch máu ở kyraotube nhưng khác là ủ ở 37 0 C trong 40 phút và ly tâm 1800 rpm trong 12 phút. -Nhỏ lam: Hút mẫu nhỏ lên lam kính đã kẻ vòng tròn để sẵn trên máy sấy lam 55 0 C, để khô. -Chuẩn bị lai: Nhúng lam vào dung dịch SSC 2X ở 37 0 C/ 60 phút nhúng qua pepsine 37 0 C/ 11 phút cho qua dung dịch PBS ở nhiệt độ phòng 4 phút nhúng vào dung dịch FA 0,95% ở nhiệt độ phòng/5 phút cho vào PBS nhiệt độ phòng 4 phút đem phơi khô nhúng qua cồn 70 0 / 2 phút cho vào cồn /2 phút phơi khô. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 32

33 -Lai: Tiến hành nhỏ probe NST 13, 18, 21, X, Y vào lai, đậy lamelle tránh bọt khí hàn lamelle bằng parafin cho vào máy lai tự động được cài đặt sẳn chương trình 75 0 C/2 phút, 37 0 C trong 24 giờ. -Xử lý mẫu sau lai: Gỡ bỏ keo bằng cách rửa với SSC 2X ở nhiệt độ phòng tiếp đến ngâm ngâm trong NP40 0,3% trong 73 0 C/ 2 phút rồi ngâm trong NP40 0,1% /1 phút ở nhiệt độ phòng. Vớt lam kính, nhỏ DAPI lên lam kính, sau đó nhỏ antifate để bảo vệ tế bào khỏi tia huỳnh quang, đậy lamelle đem đọc phân tích dưới kính hiển vi. Hình 23. Cho vào máy lai PCR Hình 24.Gỡ keo sau lai Real time PCR Vật liệu: Phết cổ tử cung từ bệnh nhân Dụng cụ và thiết bị: Plate, máy ly trích tự động DNA, pipetman, đầu côn, tube, Máy định lượng DNA Biophotometer Plus (Eppendorf), máy ly tâm, tủ cấy an toàn sinh học cấp Hóa chất: Buffer AW1, Buffer AW2, Buffer AE, Proteinase K, Buffer AL, Isopropanol, mag attract suspension Cách tiến hành: GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 33

34 Quy trình thực hiện: Thu nhận dịch nhày cổ tử cung và nhập thông tin bệnh nhân Ly trích DNA sử dụng bộ kít real time PCR của hãng SACACE BIOTECHOLOGIES và sử dụng máy ly trích DNA tự động Chạy real time PCR sử dụng máy của hãng Bioroad Phân tích Kết quả và trả kết quả -Thu nhận dịch nhầy cổ tử cung và nhập thông tin bệnh nhân. Bước này ta chủ yếu nhận dịch phết của bệnh nhân từ phòng soi cổ tử cung các khoa khám phụ khoa. Sau khi nhận ta đánh mã số cho từng mẫu, sau đó ta sẽ đánh máy lưu thong tin bệnh nhân. Hình 25. Đánh mã số cho mẫu GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 34

35 -Đưa mẫu vào tủ cấy cấp 2, bật tia uv trong 15 phút. Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp - Sau khi xong 30 phút ta tiến hành thu dịch phết cổ tử cung bằng cách đổ lọ sinh thiết ra tube 1.5ml (nếu dịch nhầy khô ta tiến hành đổ nước muối sinh lý vô trùng vào lắc đều và thu dịch). -Sau khi thu dịch xong ta tiến hành đi ly tâm mẫu 14000v/p trong vòng 1 phút để dịch nhầy lắng xuống đáy tube. -Trong khi ly tâm ta chuẩn bị pha dung dịch mastermix gồm có: buffer Al, Isopropanol, Magaffract susperision. -Tiến hành cho hóa chất và mẫu vào giếng gồm có 12 cột 1 12, 8 hàng A H. + Hàng A cho vào mỗi giếng là 65µl lysate bao gồm 2µl protease K + 20µl mẫu + 43µl mastermix ( hạt từ để bắt dính DNA). + Hàng B và C cho vào các mỗi giếng 100µl dung dịch buffer AW1.dung dịch để kết tủa protein và tạp chất. + Hàng D và E, mỗi giếng 100µl dung dịch buffer AW2( ethanol) +Hàng F 30µl dung dịch AE.( nước tinh khiết có NaCL hàm lượng thấp) Sau đó ta sẽ bỏ vào máy ly trích DNA tự động. máy sẽ tự tách DNA làm theo chu trình cài đặt sẵn. Thu được DNA ở những giếng của hàng F. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 35

36 Hình 27. Máy trích ly DNA tự động Hình 28. Bỏ mẫu vào Plate Hình 29. Plate đựng mẫu và dung dịch AW1 -Sau khi ly trích DNA ta lấy 5µl mấu DNA đã tách đem bỏ vào tube thể tích 0.2ml đã có sẵn các đoạn mồi, dung dịch đệm các mẫu dò cho trưng type hpv sau đó dem chạy trên máy real time PCR BIO-RAD có gắn hệ thống máy tính có gắn sẵn phần mềm phân tích kết quả. Mỗi lần phóng đại xong ta sẽ có tín hiệu xuất hiện trên máy, dựa vào đó ta kết luận và gửi trả kết quả cho bệnh nhân. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 36

37 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Karyotype Hình 30. Kết quả NST trên màn hình vi tính chưa sắp xếp Hình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếp Ta thấy có đủ 23 cặp NST trong đó có 22 cặp NST và 1 cặp NST XY phù hợp với NST của người bình thường. Kết luận bình thường, giới tính nam. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 37

38 Hình 32. Kết quả NST in trên giấy Nhìn hình 5 ta thấy có 22 cặp NST và 1 cặp NST giới tính XX phù hợp với NST bình thường của con người. Kết luận bình thường, giới tính nữ. 3.2.Sinh học phân tử: QF PCR -Kết quả liên quan đến NST giới tính. Nhìn hình 33 ta thấy locus SRY không có NST Y => không phải con trai. Và locus Amelogenin hiện diện 1 NST X. Tuy nhiên, sẽ có một số trường hợp đồng hợp tử các alen trên NST X dẫn đến không thể kết luận được. Lúc này kit Devyser còn có thêm những marker có thể hiện NST giới tính X khác như X1, X2, X3, X9. Trong hình ta thấy tại những vị trí X1, X2, đều có 3 NST X tỉ lệ (1:1:1), còn ở X3, X9 thì có 2 NST nhưng tỉ lệ là (1:2) và (2:1). Từ đó suy ra người này dư 1NST giới tính X hay còn gọi là bệnh siêu nữ. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 38

39 Hình 33. Kết quả Trisomy XXX Một số loại bệnh liên quan đến NST giới tính: Hình 34. Kết quả bị hội chứng Turner Hình 35. Kết quả bị hội chứng Klinefelter GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 39

40 -Kết quả liên quan đến NST 13, 18, 21. Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down) Trong hình 36, ta thấy các NST 13 và 18 đều có 1 hoặc 2 alleles. Riêng NST 21A, 21B, 21C, 21D, 21H có 3 alleles tỉ lệ lần lược là (1:2) (2:1) (1:2) (1:2) (1:2). Từ đó ta biết được người này bị hội chứng dư 1 NST số 21 (hội chứng down). Một số loại bệnh liên quan đến NST số 13 và 18: Hình 37. Kết quả Trisomy 13 (hội chứng Patau) Hình 38. Kết quả Trisomy 18 (hội chứng Edward) GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 40

41 FISH Hình 39. Kết quả FISH NST 21 và NST 13 bình thường Hình 40. Kết quả FISH 3 NST 21 hội chứng down Dựa vào hình 39 và 40, ta thấy dưới tia huỳnh quang NST 21 bắt màu đỏ. NST 13 bắt màu xanh da trời- blue (khi lai DNA với probe NST 13, 21). Hình 39 có 2 NST 21 và 2 NST 13 phù hợp với NST của người bình thường. Kết luận bình thường. Hình 40 có 2 NST 13 và 3 NST 21 không phù hợp với NST người bình thường. Kết luận bị hội chứng down. Hình 41. Kết quả FISH NST XX và NST 18 bình thường Hình 42. Kết quả FISH NST XY và NST 18 bình thường GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 41

42 Dựa vào hình 41 và 42, dưới tác dụng của tia huỳnh quang NST X bắt màu xanh lục, NST Y bắt màu đỏ, NST 18 bắt màu xanh da trời- blue (khi lai DNA với probe NST X, Y, 18). Hình 41 có 2 NST X, 2 NST 18 phù hợp với NST của người bình thường. Kết luận bình thường, giới tính nữ. Hình 42 ta thấy có cặp NST XY, 2 NST 18 phù hợp với NST của người bình thường. Kết luận bình thường, giới tính nam Realtime PCR chẩn đoán HPV Ở đây ta xét nghiệm các tube HPV băng phương pháp real time pcr các típ xét nghiệm là : -Tube HPV A9 gồm các nhóm 16, 31, 33, 35, 52 và 58 kí hiệu bắt màu xanh. -Tube HPV A5-A6 gồm các nhóm 51, 59 kí hiệu màu đỏ. -Tube HPV A7 gồm các nhóm 18, 39, 45, 59. Và được kí hiệu màu cam. -Mẫu chứng nội tại ( của bệnh nhân ) thì màu xanh dương. Điều kiện để mẫu cho kết quả là dương tính thì nó phải có đường cong cao hơn chứng nội tại ( trừ tube A5-A6 thấp hơn chứng nội tại ) và xuất hiện ở chu kì sớm ( tối đa không quá 25 chu kì ). Hình 43. Kết quả âm tính Hình 44. Kết quả dương tính GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 42

43 Ở đây ta thấy ở hình âm tính ta chỉ thấy đường cong của chứng nội tại của bệnh nhân nên ta thấy bệnh nhân không bị bệnh. Và xuất hiện sớm ở chu kì 20 của quá trình PCR. Ở kết quả dương tính ta thấy mẫu này bị nhiễm tất cả các loại tube HPV. Các tube này xuất hiện sớm trong chu ki thứ và cao hơn chứng nội tại ở tube A7, A9 và thấp hơn chứng nội tại ở tube A5-A6. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 43

44 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN Sau một thời gian thực tập tại khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ TpHCM, chúng em đã được mở rộng hiểu biết thêm về tầm quan trọng cũng như các kinh nghiệm quý báu trong quy trình xét nghiệm phát hiện bệnh, thao tác phải tỉ mĩ, gọn gàng, quan trọng nhất là không để nhầm mẫu. Với cách tổ chức, quản lý chặt chẽ, trang thiết bị cơ sở vật chất đảm bảo, các bác sĩ cùng thạc sĩ, cử nhân sinh học, xét nghiệm tài giỏi và y đức đáp ứng nhu cầu ngày cao của nhân dân. Qua quá trình thực tập tại khoa, chúng em đã được tạo đầy đủ điều kiện học tập với đúng nội dung đã đăng ký đồng thời giúp em củng cố kiến thức đã học cũng như nắm được cách vận dụng lý thuyết vào thực tế. Qua đây chúng em cũng hiểu thêm trách nhiệm của người bác sĩ phải làm trong công tác chăm sóc sức khỏe cho nhân dân.được sự giúp đỡ của các cán bộ bác sĩ, thạc sĩ, cử nhân sinh học và xét nghiệm tại khoa xét nghiệm di truyền y học và quý Thầy Cô khoa công nghệ sinh học và kỹ thuật môi trường, chngs em đã hoàn thành bài báo cáo thực tập tại khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ TpHCM. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 44

45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục. [2] Trần Thị Thanh Hương, Hoàng Thu Lan Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn,Thị Quỳnh Thơ, Nguyễn Danh Cường (2007), Chẩn đoán trước khi sinh hội chứng down, hội chứng turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối, Bộ môn Y Sinh học Di truyền - Trường Đại học Y Hà Nội,Bệnh viện Phụ sản Trung Ương. [3] Nguyễn Anh Trí, Trần Công Hoàng, Kỹ thuật FISH và ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh huyết học. Tài liệu tiếng anh [1] Haissam Rahil1, Je rome Solassol, Christophe Philippe, et al. Rapid detection of common autosomal aneuploidies by quantitative fluorescent PCR on uncultured amniocytes. Eur J Hum Genet. 2002, Aug,10 (8), pp PMID: [PubMed - indexed for MEDLINE] [2] Marina D.M Lima a, b, Paulo Henrique Braz-Silva a, c, Sônia M. Pereira d, Catalina Riera e, Ariane C. Coelho f, Marina Gallottini a 2014, Oral and cervical HPV infection in HIV-positive and HIV-negative women attending a sexual health clinic in São Paulo, Brazil ) [3] Winfried Schmidt, Jutta Jenderny, Kurt Hecher, et al. Rapid prenatal diagnosis of aneuploidy for chromosomes 21, 18, 13, and X by quantitative fluorescence polymerase chain reaction. Fetal Diagn Ther. 2006, 21 (4), pp PMID: [PubMed - indexed for MEDLINE]. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 45