1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sữa là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng trong đời sống hàng ngày cho con người. Xã hội phát triển, điều kiện sống được

Bản ghi

1 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sữa là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng trong đời sống hàng ngày cho con người. Xã hội phát triển, điều kiện sống được nâng cao thì nhu cầu sử dụng sữa hàng ngày cũng tăng theo. Tuy nhiên, theo báo cáo tới năm 2014 thì việc gia tăng đàn bò sữa ở nước ta khá chậm, không đáp ứng đủ nhu cầu dùng sữa của người tiêu dùng. Để giải quyết vấn đề trên, việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật cao cho công nghệ sinh sản nhằm nâng cao số lượng và chất lượng sữa là rất cần thiết. Công nghệ cấy truyền phôi là một công cụ hữu ích để thực hiện điều đó. Cấy truyền phôi bao gồm, kỹ thuật gây rụng trứng nhiều để sản xuất phôi in vivo, tạo phôi in vitro từ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, chia cắt phôi, cấy phôi cho bò nhận. Sự thành công của công nghệ cấy truyền phôi cho phép khai thác tối đa bò cái có giá trị di truyền cao, phổ biến và nhân nhanh giá trị di truyền đó vào thực tế sản xuất, rút ngắn tối đa thời gian cải tiến và lai tạo giống. Song, khả năng ứng dụng vào thực tế sản xuất của công nghệ cấy truyền phôi vẫn còn nhiều hạn chế. Một trong số những hạn chế đó chính là phôi sản xuất ra không được xác định tính biệt cái nên không thể kiểm soát được số bê đực, bê cái sinh ra. Ở nước ta, trong chăn nuôi bò sữa, bê đực sau khi sinh ra thường bị giết thịt với giá thấp hơn nhiều so với bê cái làm ảnh hưởng tới thu nhập của người chăn nuôi và làm hạn chế việc tăng nhanh số lượng đàn bò sữa ở nước ta. Cùng với sự phát triển nhanh của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ sinh sản, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công và thương mại hóa tinh trùng tính biệt cái. Thành công này, đã mở ra một triển vọng mới trong ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta, cho phép sản xuất phôi in

2 2 vivo và in vitro mang tính biệt cái. Tuy nhiên, kết quả sản xuất phôi từ tinh trùng đã xác định tính biệt cái đang có nhiều biến động do là số lượng tinh trùng mang tính biệt cái/cọng rạ thấp hơn rất nhiều so với tinh chưa xác định tính biệt cái và sức sống của tinh trùng phần nào bị ảnh hưởng do trải qua quá trình phân ly giới tính. Chính vì lẽ đó, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi in vitro và in vivo trên bò Holstein Friesian 2. Mục tiêu của đề tài - Đánh giá được sự ảnh hưởng của một số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi in vitro và in vivo. - Xác định được một số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng đã xác định tính biệt cái tăng được số lượng và chất lượng phôi in vitro và in vivo thu được. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Nâng cao cường độ chọn lọc giới tính ở bò. - Tăng khả năng ứng dụng công nghệ cấy truyền phôi vào thực tế sản xuất. - Hạ giá thành bê cái sinh ra bằng công nghệ cấy truyền phôi.

3 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bu ng t ng ấu t o bu ng trứng uồng trứng bò gồm một đôi treo ở cạnh trước dây chằng rộng gần mút sừng tử cung nằm trong xoang bụng của gia súc cái. Nó có chức năng sản sinh, dự trữ các tế bào sinh dục cái trứng và tiết hormon sinh dục cái estrogen và progesteron. uồng trứng bò có hình bầu dục, hình ô van d t... úc mới sinh buồng trứng có khối lượng khoảng 0,3g, khi trưởng thành có khối lượng từ 10-20g. ích thước buồng trứng cũng thay đổi tùy thuộc vào cá thể, tuổi tác, trạng thái hoạt động, chế độ dinh dưỡng ích thước trung bình của buồng trứng theo 3 chiều dài x rộng x dày lần lượt là 35 x 25 x 15 mm (Bearden và cs., 2000) [9] Nang tr ng nguyên thủy Nang tr ng Đang phát t iển (Tertiary) Nang tr ng sắp ụng Nang tr ng ụng Tế ào t ng Nang tr ng th cấp Nang t ng thoái hóa Thể vàng Thể huyết Thể ạch Hình 1.1. Cấu tạo của u ng t ng (Nguồn: Bearden và Fuquay, 2000) [9] uồng trứng được chia làm 2 miền miền v ở bên ngoài và miền tủy ở bên trong. Miền v có chức năng sinh l sinh sản là sản sinh tế bào trứng,

4 4 được cấu tạo từ nhiều lớp tế bào. ớp ngoài cùng của miền v là lớp biểu mô, gồm nhiếu tế bào có dạng lập phương. ên dưới lớp biểu mô là một lớp m ng, gồm nhiều mô liên kết còn gọi là lớp áo trắng buồng trứng. hía dưới lớp áo trắng buồng trứng là lớp nhu mô. ớp này chứa các nang trứng nên được gọi là lớp chức năng. Miền v có các nang trứng phát triển ở các giai đoạn khác nhau, có thể có thể vàng, thể bạch Miền tủy nằm ở phía trong miền v, có chứa nhiều dây thần kinh, mạch máu và tổ chức liên kết, có nhiệm vụ nuôi dưỡng, bảo vệ các tế bào trứng nguyên thủy. 2 hức năng của bu ng trứng uồng trứng bò là cơ quan sinh sản của gia súc cái, sản sinh ra tế bào trứng và các hormone sinh sản của gia súc cái oestrogen và progestins. hi buồng trứng có các nang trứng thành thục, các tế bào hạt trong biểu mô nang trứng tiết ra nhiều oestrogen, oestrogen tạo nên các đặc tính sinh dục thứ cấp của gia súc cái làm âm đạo tiết ra nhiều dịch nhầy, âm hộ xung huyết đ, sừng tử cung và ống dẫn trứng dinh dưỡng được tăng cường, tuyến vú phát triển, v não hưng phấn con vật xuất hiện động dục. Đồng thời tiết ra hormone progesterone từ thể vàng đi vào máu sau khi rụng trứng, có tác dụng kích thích niêm mạc tử cung, tăng cường dinh dưỡng, màng nhầy phát triển để trứng được thụ tinh về nơi làm tổ, đồng thời còn tác dụng tới tế bào biểu mô màng nhầy tử cung tiết ra nhiều glycogen và các chất dinh dưỡng nuôi phôi, giúp phôi bám chặt vào thành tử cung và phát triển. rogesterone còn ức chế nang trứng chín trên buồng trứng, thông qua sự ức chế của FSH ức chế cơ trơn tử cung làm giảm co bóp, giảm hormone thùy sau tuyến yên làm cho tử cung yên tĩnh trong thời gian mang thai. Ngoài ra, progesterone còn kích thích tuyến vú phát triển. ớp ngoài cùng của miền v buồng trứng là biểu mô bề mặt, ngay bên dưới biểu mổ bề mặt là một lớp m ng, dày đặc các mô liên kết, phía

5 5 dưới lớp mô dày đặc là nhu mô có chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng. hu k của bu ng trứng Chu k của buồng trứng có quan hệ chặt chẽ và quyết định chu k động dục của cơ thể gia súc. Chu k của buồng trứng bò trung bình là 21 ngày dao động từ Chu k buồng trứng gồm 2 pha pha nang trứng và pha thể vàng. uồng trứng bắt đầu hoạt động theo chu k khi gia súc thành thục về tính, ở bò là tháng. Trong đó bò sữa với điều kiện nuôi tốt là tháng, bò vàng địa phương là tháng, ở bò Holstein là 11 tháng. Ở bò có 2-3 đợt sóng nang phát triển trong một chu k tính. Trong mỗi sóng có một nang trứng phát triển nhanh hơn các nang trứng khác và trở thành nang trội. Mặc dù nang trội của mỗi đợt sóng nang có khả năng phát triển đến rụng trứng, nhưng do bị progesterone của thể vàng ức chế nên không phát triển đến giai đoạn rụng trứng mà bị thoái hóa, chỉ có một nang trội của đợt sóng nang cuối cùng phát triển đến giai đoạn rụng trứng do thể vàng thoái hóa làm progesterone giảm xuống mức thấp. Độ dài pha thể vàng của chu k động dục sử dụng progesterone ngoại sinh làm kéo dài chu k động dục và tạo ra sự luân chuyển của nang trội. Nồng độ progesterone cao hơn ức chế sự liên tục của sóng H uteinising Hormone, hormone hoàng thể hóa do tuyến yên tiết ra, có tác dụng kích thích rụng trứng và phát triển thể vàng ở con cái làm cho nang trội có thời gian sống ngắn hơn. rogesterone ức chế sự ảnh hưởng lên sự phát triển của pha nang trội do vậy các mức độ progesterone của thể vàng bình thường thúc đẩy sự thoái hóa của các nang trội và tạo ra sóng nang mới (Adams và cs,1992) [6]. Tăng tính liên tục của nhịp H kéo dài sự phát triển của nang trội và tạo ra các cơ chất để tổng hợp estradiol, tăng nồng độ estradiol trong máu từ nang

6 6 trội. Nồng độ estradiol trong máu cao ức chế các sóng FSH và làm cho các nang trứng có kích thước từ 5mm hay lớn hơn không xuất hiện và hình thành các nang trội mới (Sirois và Fortune, 1990) [50]. Ở chu k động dục thường có 2 đợt sóng nang, các nang trứng rụng phát triển ở trong trạng thái progesterone cao hơn so với chu k động dục có 3 đợt sóng nang. Tương tự ở chu k động dục có 2 đợt sóng nang, sự phát triển của các nang trứng đến giai đoạn rụng trứng dài hơn chu k động dục có 3 đợt sóng nang 11 ngày so với ngày và do vậy, nang trứng rụng ở chu k động dục có 2 đợt sóng nang có kích thước to hơn 1 mm so với 14mm) (Ginther và cs, 1989) [18]. Do thời gian phát triển của nang trứng ở chu k động dục có 2 đợt sóng nang, dài hơn chu k động dục có 3 đợt sóng nang, do vậy các nhà khoa học đã nghiên cứu và so sánh tỉ lệ có chửa và một số các tác giả cho rằng, ở chu k có hai đợt sóng nang tỉ lệ có chửa thấp hơn (Townson và cs, 2002) [51]. Song, một số tác giả khác lại cho thấy không có sự khác nhau về tỉ lệ có chửa ở bò có hai đợt sóng nang trong chu k động dục (Ahmad và cs, 1997) [7] Nang t ng 2 h nh thành nang trứng bò Sự hình thành nang trứng trải qua nhiều giai đoạn khác nhau. úc đầu, v buồng trứng có tế bào mầm, các tế bào này nguyên phân nhiều lần tạo ra liên bào mầm. Ở giai đoạn bào thai của gia súc cái, những nang trứng ở giai đoạn phát triển thấp xuất hiện từ sự phát triển của liên bào mầm, gọi là nang sơ cấp nang bậc I. Ở bê, từ ngày của giai đoạn phôi thai, số nang sơ cấp đạt số lượng lớn nhất. Nang sơ cấp gồm 1 tế bào sinh dục được bao quanh bởi 1 lớp tế bào hạt. Nang sơ cấp nằm trong lớp nhu mô của v buồng trứng. Các

7 7 tế bào hạt của nang sơ cấp tăng sinh tạo thành 2 hay nhiều lớp tế bào hạt bọc quanh 1 tế bào trứng có khả năng phát triển để tạo thành nang thứ cấp nang bậc II. Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt của nang thứ cấp tiết ra dịch nang trứng, đẩy chúng tách kh i tế bào trứng và tạo thành một xoang. Xoang này hình thành vào khoảng ngày 130 của thời k phôi thai (Bearden va cs, 2000) [9]. Nang trứng lúc này là nang bậc III. Dịch nang trứng nhớt và chứa nhiều hormon. Nang bậc III phát triển thành thục chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt lớp v buồng trứng, được gọi là nang Graff. Nang Graff cấu tạo từ nhiều lớp tế bào bao quanh 1 tế bào trứng có khả năng phát triển ngoài cùng là lớp tế bào sợi tế bào v bên ngoài, tiếp đến là lớp tế bào v bên trong. Có nhiều mạch máu ở giữa lớp tế bào v bên ngoài và lớp tế bào v bên trong. Hai lớp tế bào này có chức năng sản sinh và tiết hormon estrogen. Dưới lớp tế bào v bên trong là lớp tế bào mềm, có chức năng ngăn cách, không cho các mạch máu di chuyển vào lớp tế bào bên trong. ao quanh xoang nang là các tế bào hạt. Những tế bào hạt tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng tạo thành vành phóng xạ. Tế bào hạt có vai trò chủ đạo trong việc tiết progesterone của thể vàng sau này. hía trong cùng là một tế bào sinh dục cái trứng. Trứng nằm trong khối tế bào cumulus với các tế bào hạt bao quanh. Sự lớn lên của nang trứng chậm hơn so với tế bào trứng nang trứng tăng hơn 50 kích thước thì tế bào trứng tăng trên 0 earden và cs, 2000) [9]. Sự rụng trứng xảy ra sau khi nang trứng đã thành thục. 2 2 hức năng của nang trứng Nang trứng là một khối thống nhất chặt chẽ, có nhiều loại tế bào riêng biệt. Nang trứng bao gồm một số lớp tế bào xôma bao quanh, bên trong chứa đầy dịch, trong dịch có chứa tế bào trứng. Dịch trong xoang của nang trứng được gọi là dịch nang trứng. Nang trứng cung cấp tiểu môi trường để tế bào

8 8 trứng phát triển từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn tiền rụng trứng và chịu trách nhiệm sản suất ra các loại hormone. ớp v của nang trứng tiền rụng trứng bao gồm màng tế bào hạt, tế bào theca interna và tế bào theca externa. Các tế bào hạt là các tế bào có nguồn gốc từ các tế bào biểu mô, rất cần thiết cho quá trình phát triển và sự sống sót của tế bào trứng. Các tế bào hạt không phải là các mô đồng nhất mà là các tập hợp con đặc biệt bao gồm vành phóng xạ, tế bào cumulus và các tế bào hạt của nang phát triển. Tế bào cumulus là tập hợp con của tế bào hạt bao bọc xung quanh tế bào trứng. Các tế bào cumulus có mối liên kết chặt chẽ với tế bào trứng và được biết đến như vành phóng xạ. Chúng liên kết chặt chẽ với các tế bào trứng qua khe liên kết của tế bào chất qua vòng trong suốt zona pellucida. Vành phóng xạ liên kết tế bào trứng với các tế bào cumulus khác qua chỗ nối các khe hở vì thế tạo nên dòng điện hợp bào sinh học (De loos và cs,1991) [14]. Các tế bào cumulus nuôi dưỡng tế bào trứng và tham gia hình thành vòng trong suốt. Ngoài ra các tế bào cumulus cũng tham gia vào sự điều chế hay tạo ra chất ức chế sự phát triển của tế bào trứng. Có thể nói chức năng của nang trứng liên quan mật thiết đến sự sống và phát triển của tế bào trứng Tế ào t ng h nh thành phát tri n tế bào trứng Tế bào trứng được hình thành từ buồng trứng của gia súc cái, được biệt hóa cao độ, có khả năng kết hợp với giao tử đực để hình thành hợp tử. Sự hình thành, phát triển của trứng được chia làm 3 giai đoạn giai đoạn tăng số lượng, giai đoạn sinh trưởng và giai đoạn hình thành trứng Giai đoạn tăng số lượng giai đoạn này bắt đầu ngay từ thời k bào thai của gia súc cái. Tế bào mầm nguyên thủy phân chia tạo thành các tế bào trứng đầu tiên noãn nguyên bào. Tại nhu mô của v buồng trứng, các noãn nguyên

9 9 bào phân chia nhiều lần liên tiếp để tăng nhanh số lượng. Giai đoạn này kết thúc trước khi gia súc con được sinh ra. hi mới sinh, bê cái có khoảng noãn nguyên bào. Giai đoạn sinh trưởng noãn nguyên bào tích lũy chất dinh dưỡng, tăng nhanh về số lượng để hình thành noãn bào sơ cấp noãn bào cấp I, chứa bộ NST lưỡng bội 2n. Giai đoạn hình thành trứng các noãn bào cấp I bước vào thời k đầu của phân bào giảm nhi m lần 1 ở giai đoạn bào thai. ết thúc giảm phân lần 1, từ 1 noãn bào cấp I tạo ra 1 tế bào trứng thứ cấp noãn bào cấp II và thể cực thứ nhất nằm giữa màng phóng xạ và màng trong suốt. ộ NST giảm từ lưỡng bội kép ở noãn bào cấp I xuống đơn bội kép trong noãn bào cấp II. Thời điểm kết thúc giảm phân 1 tùy thuộc vào loài ở bò, cừu, lợn là trước khi rụng trứng ở ngựa là ngay sau khi rụng trứng. 2 ấu t o tế bào trứng Tế bào trứng có cấu tạo gồm 3 phần màng, nguyên sinh chất và nhân. Màng tế bào trứng gồm Màng ngoài hay màng phóng xạ gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp được gắn với nhau bởi axit hyaluronilic. Các tế bào này phân bố xung quanh trứng theo hình phóng xạ. Màng ngoài còn được gọi là vòng tia. Màng giữa màng trong suốt là lớp tế bào nuôi dưỡng trứng, gồm nhiều tế bào do lớp tế bào nang sinh ra. Màng giữa có mấu lồi ra từng đoạn hình răng cưa hướng ra phía các tế bào nang của màng ngoài. Màng trong còn gọi là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất đây là lớp màng trong cùng, m ng, bao bọc nguyên sinh chất. Màng trong có tác dụng nuôi dưỡng trứng đã thụ tinh. Màng giữa và màng trong có tính đặc hiệu cho loài, chỉ những tinh trùng cùng loài mới có khả năng tiết enzyme tương ứng để thủy phân và thâm nhập tế bào trứng.

10 10 Nguyên sinh chất thành phần chủ yếu là nước, vật chất hữu cơ, muối khoáng và các thành phần khác. Nhân tế bào trứng gồm NST và nhân con, có chức năng lưu giữ và truyền đạt thông tin di truyền Cơ chế thần kinh và thể dịch điều khiển sự phát t iển của noãn nang Sự phát triển của noãn nang chịu sự điều khiển chặt chẽ nhịp nhàng của hệ thống thần kinh thể dịch hypothalamus - tuyến yên - tuyến sinh dục. Đến tuổi thành thục về tính, các tác động của ngoại cảnh mùi, hình dáng con vật khác giới, những thay đổi về ánh sáng, thức ăn kích thích vào thần kinh trung ương, đầu tiên vào v đại não, rồi xuống vùng dưới đồi kích thích bài tiết các hormone Follicle Realising Hormon (FRH) kích thích thùy trước tuyến yên tiết các kích tố sinh dục tương ứng Follicle Stimulating Hormon FSH, uteinzing Hormon H. Các kích tố này kích thích sự phát triển các noãn nang của buồng trứng. Trong hàng loạt các nang phát triển xuất hiện nang trứng phát triển nhanh hơn trở thành nang trội. Estradiol và Inhibin được tổng hợp từ các tế bào hạt của nang trội, tạo ra một hàm lượng estradiol và Inhibin tăng cao. Estradiol tác động ngược dương tính vào hypothalamus, làm hàm lượng H tăng cao kích thích nang trội giải phóng tế bào trứng. Inhibin tác động ngược âm tính làm giảm hàm lượng FSH dưới ngưỡng cần thiết đối với sự tồn tại của các nang còn lại làm thoái hóa các nang trứng còn lại. Song ở hàm lượng FSH thấp nang trội vẫn có khả năng phát triển và rụng trứng do nang trội có sự mẫn cảm với FSH nhờ sự có mặt của IGF-1 (Insulin liked Growth Factor-1 Yếu tố sinh trưởng giống Insulin trong tế bào với hàm lượng cao hơn và nang trội có cơ quan thụ thể để tiếp nhận H trên các tế bào hạt sớm hơn các nang khác và do vậy khả năng sống của nang trội dưới các